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カルシウムチャネルの機能修飾と細胞膜への動員機構との関連

钙通道功能修饰与细胞膜募集机制之间的关系

基本信息

批准号：
14770015
负责人：
長島雅人
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Sapporo Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度はL型カルシウムチャネル関連分子であるJun activation domain binding protein(JAB)の機能解析を試みた。昨年行ったRT-PCR法による検討により、JABは、心筋以外の組織にも比較的発現が多く、ubiquitousな分子と考えられ、再構成系で使用するCos7細胞にも多く発現していることが明かになった。よって、Cos7細胞に発現している内因性のJABをsiRNAを用いてノックダウンして、カルシウム電流への作用の解析をしようとした。JABのN末のシークエンス情報をもとに、siRNAを2箇所で設定した。まずコントロール実験として、siRNAでJABの発現が本当に抑制されているかを確認するため、siRNAの作成のために設定した、2箇所の配列の両方をはさむようにプライマーを設定し、Cos7細胞から抽出したmRNAに対してoligodTプライマーでRTを施行し、設定した2つのプライマーでPCRを施行した。その結果、コントロールのsiRNAをトランスフェクションした細胞では、PCRサイクル25回で遺伝子の増幅が認められたのに対して、JABを標的としたsiRNAを発現させた細胞では、2種類ともPCRサイクル35回施行しても遺伝子の増幅を認められなかった。これによりsiRNAにより、JABの発現が抑制されていることが明かになったので、これを利用してカルシウム電流への影響を解析したが、今研究期間中において明確な結果を得ることは出来なかった。今後、Myc tagで標識したJABを作成し、抗Myc抗体を用いて、免疫沈降法で再構成系の細胞のなかでJABとL型カルシウムチャネルのα1cサブユニットが実際に結合しているか確認する実験を行いたいと考えている。

This year, we tried to analyze the function of Jun activation domain binding protein(JAB). In the past year, RT-PCR method was used to detect and compare the occurrence of multiple, ubiquitous molecular tests and reconstruction systems in Cos7 cells. Analysis of the role of endogenous JAB siRNA in the development of Cos7 cells JAB's N terminal information is set in two places, siRNA. The expression of JAB in Cos7 cells was determined by PCR. The expression of JAB was determined by PCR. The results showed that the siRNA expression in the cells was increased by 25 cycles of PCR, and the siRNA expression in the cells was increased by 35 cycles of PCR. The expression of siRNA and JAB was inhibited by the analysis of the effects of siRNA and JAB on the expression of JAB. In the future, Myc tag identification, JAB preparation, anti-Myc antibody use, immunoprecipitation method, reconstitution of cell lines, JAB, L-type cell cycle, α1c cell cycle, and real-time binding, identification, and testing will be conducted.