発生期心筋におけるNa-Ca交換担体の分子構造と機能連関について

当初は、ラット胎児型Na-Ca交換担体遺伝子のクローニングの方法として、胎児心筋(胎生18日目)の遺伝子ライブラリーを作成し、ハイブリダイゼーションによる、クローニングを試みた。しかしながら、胎児心筋において高品質の遺伝子ライブラリーを作成することは、想像以上に難しく、この方法では、結局、目的の遺伝子を単離するまでには、至らなかった。よってRT-PCRを利用したクローニング法に変更。まず、AGPC法を用いて、胎生18日目のラットの心室筋から、mRNAを抽出し、既に報告されている。ラット(成体)のNa-Ca交換担体の遺伝子配列を基にPCRプライマーを作成、第7膜貫通部位と第11膜貫通部位の間に相当する領域にRT-PCRを施行。目的の遺伝子と思われるPCR産物をpGEM Vectorに組み込み、大腸菌に導入することで、クローン化に成功した。得られたDNAのシークエンスをダイデオキシン法を用いて行ったところ、この領域においては、塩基レベルでの遺伝子変異は、いくつか認められるものの、アミノ酸レベルの変異は、認められなかった。現在地の部位についてのシークエンスも同様の方法で、行っている。遺伝子ライブラリーの作成と、そのスクリーニングによるクローニング法に難渋したため、研究の進行は遅れていたが、RT-PCRを利用したクローニング法に変更してからは、比較的順調に進んでおり、今後は、全長のシークエンスを決定し、機能解析へと、進む予定である。補助金により購入した、トランスイルミネーター、エレクトロポレーターは、それぞれDNAの確認、大腸菌への遺伝子導入に汎用しており、本研究の遂行に多大な貢献をしている。

当初は、ラット胎児型Na-Ca交換担体遺伝子のクローニングの方法として、胎児心筋(胎生18日目)の遺伝子ライブラリーを作成し、ハイブリダイゼーションによる、クローニングを試みた。しかしながら、胎児心筋において高品質の遺伝子ライブラリーを作成することは、想像以上に難しく、この方法では、結局、目的の遺伝子を単離するまでには、至らなかった。よってRT-PCRを利用したクローニング法に変更。まず、AGPC法を用いて、胎生18日目のラットの心室筋から、mRNAを抽出し、既に報告されている。ラット(成体)のNa-Ca交換担体の遺伝子配列を基にPCRプライマーを作成、第7膜貫通部位と第11膜貫通部位の間に相当する領域にRT-PCRを施行。目的の遺伝子と思われるPCR産物をpGEM Vectorに組み込み、大腸菌に導入することで、クローン化に成功した。得られたDNAのシークエンスをダイデオキシン法を用いて行ったところ、この領域においては、塩基レベルでの遺伝子変異は、いくつか認められるものの、アミノ酸レベルの変異は、認められなかった。現在地の部位についてのシークエンスも同様の方法で、行っている。遺伝子ライブラリーの作成と、そのスクリーニングによるクローニング法に難渋したため、研究の進行は遅れていたが、RT-PCRを利用したクローニング法に変更してからは、比較的順調に進んでおり、今後は、全長のシークエンスを決定し、機能解析へと、進む予定である。補助金により購入した、トランスイルミネーター、エレクトロポレーターは、それぞれDNAの確認、大腸菌への遺伝子導入に汎用しており、本研究の遂行に多大な貢献をしている。