癌塞栓療法に用いる組換えタンパク質の創成

创建用于癌症栓塞治疗的重组蛋白

• 批准号: 14780639
• 负责人: 尾形 信一
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14780639/
• 关键词: 癌; 血管新生; 血液凝固因子; トロンビン; エラスターゼ; 塞栓療法

本研究では,癌部位の新生血管内特異的に血栓を形成させる,変異型プレトロンビン-2(以下PT-2)の創成を目的とした。具体的には,野生型PT-2のアミノ酸配列上において,本来,Xa因子によって切断されるアミノ酸配列を,癌部位で有意に高発現している,エラスターゼの切断配列に変換した変異型PT-2の作製を目指す。昨年度までに研究代表者は,1)エラスターゼによって切断されるアミノ酸配列の探索と同定,2)大腸菌内で変異型PT-2を発現させるベクターの構築,を行った。本年度は,組換えタンパク質の発現・精製,ならびにエラスターゼによるトロンビン活性の検討を行った。A)変異型PT-2の発現と精製昨年度構築した発現ベクターを用いて,エラスターゼ切断配列を有する変異型PT-2を,マルトース結合タンパク質(以下MBP)との融合タンパク質として発現させた。変異型PT-2は,可溶性画分に回収され,アミロース担体を用いたカラムクロマトグラフィーによって精製を行った。精製画分をSDS-PAGEに供したところ,CBB染色上,ほぼ単一バンドにまで精製することができた。B)変異型PT-2の活性測定先ず,変異型PT-2に対してエラスターゼを作用させ,切断の状態を,SDS-PAGEによるバンドパターンの変化として追跡した。その結果,トロンビンB鎖に相当する分子量のバンドが検出され,変異型PT-2は,変異導入部位において切断されることが示唆された。次に,エラスターゼによって切断した変異型PT-2を,トロンビンの蛍光ペプチド基質であるBoc-Val-Pro-Arg-AMCに作用させ,活性測定を行ったところ,基質の切断に起因する蛍光強度の上昇が認められ,トロンビン活性を発現することが示された。

This study aims to investigate the formation of thrombus specific to neovascularization in cancer sites, and to investigate the formation of heteromorphic thrombus-2 (PT-2 below). Specifically, wild-type PT-2 has a high level of activity in the absence of acid alignment, which is indicated by factor Xa in the absence of acid alignment in cancer sites. Last year, the research representatives were: 1) exploration and identification of acid sequence in Escherichia coli, 2) development of heterotypic PT-2 in Escherichia coli, and 3) construction of heterotypic PT-2 in Escherichia coli. During the year, the Group conducted research on the development, refinement and activity of new products. A) Development and refinement of heteromorphic PT-2. Construction of heteromorphic PT-2 in the past year, development of heteromorphic PT-2, development of heteromorphic PT-2 Different PT-2, soluble protein analysis and purification SDS-PAGE is used for purification,CBB staining is used for purification. B) The activity of variant PT-2 was determined first, and the activity of variant PT-2 was determined by SDS-PAGE. As a result, the molecular weight of PT-2 is equivalent to that of PT-2, which is different from that of PT-2. In addition, the increase in fluorescence intensity due to substrate cleavage was identified as the cause of substrate cleavage.