高等植物のプログラム細胞死を司る液胞プロセシング機構の解析

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液胞の機能転換に必須なタンパク質の成熟化に関与する酵素として液胞プロセシング酵素(vacuolar processing enzyme ; VPE)が見つかっている.VPEは老化や傷害時・ウィルス感染・導管形成により強く発現することから,植物の細胞死や防御機構に関与していることが考えられる.そこで,本研究は,細胞死におけるVPEの機能について解析すること,液胞に局在するVPEを介したプロセシング系の解明を試みることを目的として,高等植物の細胞死機構を明らかにすることを目指す.(1)フモニシンB1によって誘導された細胞死におけるVPEの機能解析細胞死誘導時のVPEの関与を調べるため,シロイヌナズナを用いてVPE多重変異体・過剰発現株体を作出した。植物の細胞死を引き起こすシグナルは様々だが、その中でもカビ毒の一つであるフモニシンB1(FB1)に着目し、シロイヌナズナに細胞死を誘導する系を確立した.野生型の葉にFB1を処理すると,経時的に細胞死が引き起こされるが,一方VPE多重変異体では細胞死が抑制されるという結果が得られた.細胞死が起きる際の形態変化を電子顕微鏡観で観察したところ,野生型の葉で液胞の崩壊を伴う細胞死が起きており,変異体では液胞膜の分解は見られなかった.VPEはシロイヌナズナの中に4つのホモログが存在する.VPE1重変異体を用いて,どのVPEが細胞死誘導時に必須であるか調べたところ,死にゆく細胞で発現量の高いγVPEがFB1誘導時において重要な働きをすることがわかった.以上の結果から,VPEはFB1によって誘導される細胞死に関与することが明らかになった.(2)カスパーゼ活性を示すVPEVPEは動物細胞死において中心的な役割を果たすカスパーゼ-1と酵素学的に相似性のある特徴を示すことをin vitroにおける生化学的解析で明らかにした.VPEとカスパーゼ-1の阻害剤をFB1と同時に処理したところ,病斑形成は抑制された.さらに,FB1誘導時の野生型のVPEとカスパーゼ-1活性は検出されたが,VPE多重変異体では検出されなかった.以上の結果から,VPEはカスパーゼ-1活性をもつ酵素であることが証明された.(3)VPEを中心としたプロセシング系の確立VPEは液胞に局在するのでその標的タンパク質が液胞にあると考え、野生型とノックアウト変異体から液胞を単離することにした。現在大量に液胞を単離精製し、プロテオーム解析を行っている.