液胞の分化を支える機能タンパク質の網羅的解析法の確立

本研究では,液胞プロセシングの機構を利用して,細胞の分化を支えている液胞の機能タンパク質を網羅的に同定し,その局面での液胞の働きを総合的に把握することを目指す.私達が見出した液胞プロセシング酵素(VPE ; Vacuolar Processing Enzyme)は様々な液胞タンパク質の成熟化や活性化に関与する酵素で,液胞の機能発現を制御している.この酵素が欠損すると,液胞タンパク質は成熟化が起こらず,分子量の大きな前駆体のまま蓄積することになる.シロイヌナズナのVPE欠損変異体の胚発生時,老化葉,病原体感染葉などに蓄積している前駆体タンパク質を網羅的に同定することにより,そこで働くタンパク質の内,液胞タンパク質のみを知ることができる.上記の目的のために,シロイヌナズナの4種類のVPEホモログ(αVPE,βVPE,γVPE,δVPE)のT-DNAタグラインを取得し,ホモラインを確立した.これらの4種類のVPE欠損株をかけ合わせることにより,様々な組み合わせの二重,三重,四重の欠損株を作製した.この際にバックグラウンドはエコタイプCol-0にそろえた.シロイヌナズナの成熟葉から液胞を単離・精製する方法を確立した上で,VPEの四重欠損変異体と野生型の成熟葉から液胞を単離した.その分画を2次元電気泳動で分離し,そのパターンの比較から,挙動が異なるスポットを取り出し,トリプシン消化後質量分析の解析を順次行った.この解析から,成熟葉の液胞に存在するGDSLリパーゼが候補として浮上してきた.この特異抗体を作製し,免疫電顕により液胞への局在化が明らかになった.一方,GDSL遺伝子を欠損しているシロイヌナズナ変異体の表現形の解析も併せて行った.

本研究では,液胞プロセシングの機構を利用して,細胞の分化を支えている液胞の機能タンパク質を網羅的に同定し,その局面での液胞の働きを総合的に把握することを目指す.私達が見出した液胞プロセシング酵素(VPE ; Vacuolar Processing Enzyme)は様々な液胞タンパク質の成熟化や活性化に関与する酵素で,液胞の機能発現を制御している.この酵素が欠損すると,液胞タンパク質は成熟化が起こらず,分子量の大きな前駆体のまま蓄積することになる.シロイヌナズナのVPE欠損変異体の胚発生時,老化葉,病原体感染葉などに蓄積している前駆体タンパク質を網羅的に同定することにより,そこで働くタンパク質の内,液胞タンパク質のみを知ることができる.上記の目的のために,シロイヌナズナの4種類のVPEホモログ(αVPE,βVPE,γVPE,δVPE)のT-DNAタグラインを取得し,ホモラインを確立した.これらの4種類のVPE欠損株をかけ合わせることにより,様々な組み合わせの二重,三重,四重の欠損株を作製した.この際にバックグラウンドはエコタイプCol-0にそろえた.シロイヌナズナの成熟葉から液胞を単離・精製する方法を確立した上で,VPEの四重欠損変異体と野生型の成熟葉から液胞を単離した.その分画を2次元電気泳動で分離し,そのパターンの比較から,挙動が異なるスポットを取り出し,トリプシン消化後質量分析の解析を順次行った.この解析から,成熟葉の液胞に存在するGDSLリパーゼが候補として浮上してきた.この特異抗体を作製し,免疫電顕により液胞への局在化が明らかになった.一方,GDSL遺伝子を欠損しているシロイヌナズナ変異体の表現形の解析も併せて行った.