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液胞の分化を支える機能タンパク質の網羅的解析法の確立

支持液泡分化的功能蛋白综合分析方法的建立

基本信息

批准号：
16657013
负责人：
西村いくこ
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では,液胞プロセシングの機構を利用して,細胞の分化を支えている液胞の機能タンパク質を網羅的に同定し,その局面での液胞の働きを総合的に把握することを目指す.私達が見出した液胞プロセシング酵素(VPE ; Vacuolar Processing Enzyme)は様々な液胞タンパク質の成熟化や活性化に関与する酵素で,液胞の機能発現を制御している.この酵素が欠損すると,液胞タンパク質は成熟化が起こらず,分子量の大きな前駆体のまま蓄積することになる.シロイヌナズナのVPE欠損変異体の胚発生時,老化葉,病原体感染葉などに蓄積している前駆体タンパク質を網羅的に同定することにより,そこで働くタンパク質の内,液胞タンパク質のみを知ることができる.上記の目的のために,シロイヌナズナの4種類のVPEホモログ(αVPE,βVPE,γVPE,δVPE)のT-DNAタグラインを取得し,ホモラインを確立した.これらの4種類のVPE欠損株をかけ合わせることにより,様々な組み合わせの二重,三重,四重の欠損株を作製した.この際にバックグラウンドはエコタイプCol-0にそろえた.シロイヌナズナの成熟葉から液胞を単離・精製する方法を確立した上で,VPEの四重欠損変異体と野生型の成熟葉から液胞を単離した.その分画を2次元電気泳動で分離し,そのパターンの比較から,挙動が異なるスポットを取り出し,トリプシン消化後質量分析の解析を順次行った.この解析から,成熟葉の液胞に存在するGDSLリパーゼが候補として浮上してきた.この特異抗体を作製し,免疫電顕により液胞への局在化が明らかになった.一方,GDSL遺伝子を欠損しているシロイヌナズナ変異体の表現形の解析も併せて行った.

This study aims to explore the mechanism of cell differentiation, cell differentiation, cell function, cell quality and cell integration. VPE (Vacuum Processing Enzyme) is an enzyme involved in cell maturation and activation, which controls cell function development. The enzyme is damaged, the cell phase matures, and the molecular weight of the precursor accumulates. During the development of embryos with VPE deficiency, aging leaves, pathogen infected leaves, accumulation of precursors, inclusion of precursors, and identification of pathogens within the cytoplasm, and cell morphology. The T-DNA sequence of four kinds of VPE (αVPE,βVPE,γVPE,δVPE) was obtained and identified. The four kinds of VPE deficient plants were combined and the double, triple and quadruple deficient plants were controlled. In this case, it is necessary to change the position of Col-0 to Col-0. The method of isolation and purification of mature leaf cells was established, and the mature leaf cells of VPE were isolated from wild type with quadruple damage. The analysis of the quality analysis after digestion is carried out sequentially. The analysis shows that the mature leaf vacuoles exist, and the GDSL is a candidate. This specific antibody is produced, and the immune response is detected in the cellular system. On the one hand,GDSL transmission is not damaged, and the performance of different types of analysis and transmission.