P型-ATPaseの多量体構造と機能の相関

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・全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)を用いたFITC修飾H/K-ATPaseの多量体構造と活性の相関界面活性剤を用いてFITC修飾H/K-ATPaseを可溶化し、可溶化上清に回収された多量体の存在比と、残存するPNPPase活性との相関を検討した。C12E8を界面活性剤として用いた場合残存活性は殆ど消失し、4量体も殆ど観察されないが、可溶化時にK^+を共存させることでK^+に依存した残存活性と4量体H/K-ATPaseの存在比の上昇が観察された。残存活性と各種多量体(単量体、2量体、3量体、4量体)の関係は、4量体とのみ強い正の相関が観察され(相関係数=0.84)そのほかは負の相関、もしくは有意な相関は観察されなかった。このことは、可溶化H/K-ATPaseの活性発現には4量体が必要であるという以前の結果を強く支持する。また、生理的なリガンドであるK^+の結合、それにともなう酵素の構造変化が、多量体構造に強く影響しうる可能性を示唆する。この結果は現在FEBS letterへ投稿準備中である。・H/K-ATPase細胞内フラグメントの作成多量体H/K-ATPaseの分子間での相互作用部位を検討するために、この分子の細胞内フラグメントを作成した。ATP結合領域を含むフラグメントを酵素標品に添加したところ、H/K-ATPase活性、EP形成量ともに上昇した。このことは加水分解活性の上昇は酵素の代謝回転速度の上昇によるものではなく、反応部位が増加していることによると考えられる。すなわち、多量体H/K-ATPaseの分子間相互作用が、加えたフラグメントによって阻害され、個々のサブユニットが独立に基質を加水分解する結果起こるものと考えられる。これらの結果はATP加水分解反応が多量体間の相互作用によって制御されている可能性を示唆する。