遺伝子改変動物に由来する細胞株を用いた、プリオンタンパク質の機能に関する研究

利用转基因动物细胞系研究朊病毒蛋白的功能

• 批准号: 03J10664
• 负责人: 林田 直樹
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Yamaguchi University (2005)Kanazawa University (2004)The University of Tokyo (2003)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J10664/
• 关键词: プリオン; イヌ型プリオンタンパク質; cDNAクローニング; プリオン病; 構造変換; プリオンタンパク質; RT-PCR; 胚操作; 胚移植; トランスジェニックマウス; マウススクレイピー持続感染細胞

イヌがプリオン病感染に抵抗性を持つか否かを調べるため、マウススクレイピー感染神経細胞株におけるin vitroのイヌ型プリオンタンパク質(canis prion protein, CaPrP)発現系の樹立を目指して実験を行なった。ビーグル白血球よりCaPrP cDNAのクローニングを行なった結果、他の犬種にも共通して保存され、かつCaPrP配列に特徴的なGly104が存在すること、さらに犬種間で多型の認められる101番、107番、163番のアミノ酸はそれぞれGly, Asn, Gluであり、これらの位置においても、他の犬種にも共通して認められる残基が存在することが明らかとなった。次にこのcDNAを用いて、発現ベクターであるレトロウイルスベクターpSFFにサブクローニングを行った。続いて、エレクトロポレーション法によりエコトロピック性のパッケージング細胞であるGP+E-86纖維芽細胞株にトランスフェクションを行ないその陽性クローンを選抜した後、このGP+E-86クローンとアンフォトロピックなパッケージング細胞であるPA317繊維芽細胞株との共培養法によりウイルスストックを得た。この後、このウイルスストック溶液を用いでマウス視床下部由来神経細胞株GT1-trkおよびそのマウススクレイピー感染細胞株であるScGT1-trkに対して感染を試みたが、ウェスタンブロット法によるCaPrPの検出に成功することが出来なかった。また、GP+E-86クローンにおけるCaPrPの検出も成功しなかった。GP+E-86はNIH3T3株に由来するパッケージング細胞であり、これは、他の研究グループでプリオンタンパク質を発現させる際に用いられているpsi2と由来を同一にしているが、今回、パッケージング細胞としてpsi2を用いなかったことがCaPrPの発現に困難を極めた主な原因と考えられた。また、CaPrPも他の動物種のプリオンタンパク質と同様、その配列の相同性が高いため、「CaPrPに反応せず、マウスプリオンタンパク質に反応する」抗体の選出は難しく、そのエピトープ分析から唯一このような親和選択性を満たすと思われた抗体HuM-R01をマウスプリオンタンパク質の検出に使用したが、この抗体の力価は低く、ウェスタンブロットには利用できないと考えられた。一方、同じくマウススクレイピー感染細胞株であるScN2aも我々は所持しているため、このコントロール株N2aにおいて他の抗体を使用してウェスタンブロットの検討を行なったところ、微量でも多くの種類で検出に成功した。

为了研究狗是否抗性疾病感染，我们进行了一项实验，目的是在小鼠抓感染的神经元细胞系中建立体外canis prion蛋白（CAPRP）表达系统。由于从比犬白细胞中capRP cDNA克隆的结果，据揭示，gly104通常在其他狗品种中保守，并且是CAPRP序列的特征，氨基酸101、107和163，狗之间的多态性也相应地，并且在狗中繁殖，并且在狗之间也是如此，并且存在着其他相应的犬种。这些职位。接下来，该cDNA用于亚克隆进入表达载体逆转录病毒载体PSFF。随后，GP+E-86成纤维细胞系（是一种生态包装细胞）通过电穿孔转染，选择阳性克隆，并通过共同培养GP+E-86克隆与PA317成纤维细胞系，获得了阳性克隆，并获得了病毒量。此后，我们尝试使用该病毒储备溶液感染小鼠下丘脑衍生的神经元细胞系GT1-TRK及其小鼠crapie感染的细胞系SCGT1-TRK，但它无法通过Western Blotting成功地检测到CAPRP。此外，在GP+E-86克隆中检测CAPRP并不成功。 GP+E-86是一个源自NIH3T3菌株的包装细胞，该包装细胞与PSI2相同，该菌株在其他研究组中用于表达prion蛋白，但缺乏作为本研究包装细胞的PSI2被认为是CAPRP表达极为困难的主要原因。此外，由于CAPRP具有高序列同源性，例如来自其他动物物种的prion蛋白，因此很难选择一种“对CAPRP不反应并响应小鼠prion蛋白”的抗体；然而，抗体HUM-R01是唯一一种从其表位分析中满足这种亲和力选择性的抗体，用于检测小鼠prion蛋白，但是该抗体的滴度很低，并且认为它不能用于蛋白质印迹。另一方面，我们还拥有SCN2A，这是一种小鼠crapie感染的细胞系，因此，当我们使用该对照菌株N2A中的其他抗体研究蛋白质印迹时，我们成功地发现了尽可能多的少量。