増殖抑制因子Tobを含んだ転写制御複合体因子群の探索と解析

包括生长抑制因子 Tob 在内的转录调控复合因子的搜索和分析

• 批准号: 03J61520
• 负责人: 宮坂 隆
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J61520/
• 关键词: 細胞増殖抑制因子; Tob; タンパク質複合体精製; MALDI-TOF; TOF; CCR4-Not; Cnot1; RNAi; スプライシング; Not1

私は細胞増殖抑制因子Tobの機能を解析するために、MALDI-TOF/TOFによるTob複合体因子群を同定した。はじめにFlagタグを融合したTobを安定に発現するHeLa.S3細胞株を樹立した。次に、この細胞から精製したTob複合体をSDS-PAGEにより展開しクマシー染色した結果、複数のバンドが検出され、それらをMALDI-TOF/TOFによって同定した。これらのうち250kDa付近のタンパク質は、転写制御やmRNA代謝に関わるCCR4-Not複合体の主要因子Cnot1であることがわかった。他にもCnot7を含むCCR4-Not複合体構成因子が多数同定された。またグリセロールグラジエント法によってCnot1、Tob、Cnot7が同じ複合体を形成していることもわかった。これらTob複合体因子群のなかでも、酵母や植物でも保存されており、複合体内でも足場としての機能が考えられているCnot1の機能について、RNAi法や過剰発現系用いた解析を進めた。RNAi法によって発現を抑制されたHaLa細胞の増殖は遅くなり、このことからもCnot1は細胞増殖の制御に何らかの影響をもっていることが示唆された。またcyclinD1プロモーターの活性を上昇することも見出した。上記のタンパク質精製においてmRNAのスプライシング制御に関わるSam68などのRNA結合タンパク質も複数同定され、これらのことからTobを含む複合体とmRNA代謝との関わりが推測された。Sam68の標的であるCD44 mRNAのスプライシングパターンをCnot1の過剰発現系で調べたところ、一部のバリアントフォームの発現が抑制された。以上、本研究によってCnot1が細胞周期の制御に関わっていることが示され、またCnot1のmRNAスプライシングとの関与を示唆するデータが得られた。

Analysis of the function of Tob, MALDI-TOF/TOF and Tob complex factors Flag-like fusion was established in HeLa. S3 cells. SDS-PAGE was used to analyze the results of cell purification, and MALDI-TOF/TOF was used to analyze the results. CCR4-Not complex Cnot 1 is the main factor involved in the metabolism of CCR4-Not mRNA Cnot 7 contains CCR4-Not complex components and most of them are identical. Cnot1, Tob and Cnot7 are the same complex. The function of Tob complex factor group, yeast and plant is preserved, and the function of complex is examined. RNAi method is used to analyze the function of Tob complex factor group. The RNAi method was used to inhibit the proliferation of HaLa cells. Cyclin D 1 is active. The above mentioned RNA binding complex is related to the purification of mRNA and the regulation of mRNA. The expression of CD44 mRNA in Sam68 was regulated and partially inhibited. In this study, Cnot 1 was found to be involved in cell cycle regulation, and Cnot 1 mRNA was found to be involved in cell cycle regulation.