細胞分裂期におけるモーター蛋白質の機能解析

Kidは分子量73kDaのタンパク質で、N末端にキネシン様モーター領域を、C末端にDNA結合領域をもつ構造からkinesin like DNA binding protein(Kid)と名付けられたクロモキネシンである。本研究の目的である、Kid遺伝子をコンディショナルに欠損するマウスの作製及び作製したマウスから樹立したKid欠損細胞株を用いた細胞分裂期におけるKidの機能解析に関して、本年度は以下ような研究実績を上げた。1)KidのマウスホモログmKidゲノム遺伝子の単離を行い、ターゲティングベクターの構築を行った。この際、ターゲティングベクターにはKid遺伝子を挟む形でLoxP配列を挿入し、Creリコンビナーゼを発現させることによりコンディショナルなKid遺伝子欠損ができるように工夫した。構築したターゲティングベクターのES細胞への導入、相同組み換えを起こしたES細胞のスクリーニングを行い、複数の相同組み換えES細胞クローンを得た。更に相同組み換えES細胞由来のキメラマウスを作製し、キメラマウスと野生型マウスとの掛け合わせからヘテロ組み換えマウスを得た。2)ヘテロ組み換えマウス同士の掛け合わせによって得られた胎児から、Kid遺伝子の両アリールがLoxP配列に挟まれたmKid遺伝子に組み換わったMEF(mouse embryonic fibroblast)を得た。また、レトロウイルスを用いてCreリコンビナーゼを発現させる系など、Kid遺伝子欠損細胞株を樹立するために必要な準備を整えた。同時に、Kid遺伝子欠損細胞株樹立後に発現させる目的で、Kidの各種変異体(リン酸化部位変異体、領域欠損変異体)をGFP融合タンパク質として発現させるベクターの構築を行った。

Kidは分子量73kDaのタンパク質で、N末端にキネシン様モーター領域を、C末端にDNA結合領域をもつ構造からkinesin like DNA binding protein(Kid)と名付けられたクロモキネシンである。本研究の目的である、Kid遺伝子をコンディショナルに欠損するマウスの作製及び作製したマウスから樹立したKid欠損細胞株を用いた細胞分裂期におけるKidの機能解析に関して、本年度は以下ような研究実績を上げた。1)KidのマウスホモログmKidゲノム遺伝子の単離を行い、ターゲティングベクターの構築を行った。この際、ターゲティングベクターにはKid遺伝子を挟む形でLoxP配列を挿入し、Creリコンビナーゼを発現させることによりコンディショナルなKid遺伝子欠損ができるように工夫した。構築したターゲティングベクターのES細胞への導入、相同組み換えを起こしたES細胞のスクリーニングを行い、複数の相同組み換えES細胞クローンを得た。更に相同組み換えES細胞由来のキメラマウスを作製し、キメラマウスと野生型マウスとの掛け合わせからヘテロ組み換えマウスを得た。2)ヘテロ組み換えマウス同士の掛け合わせによって得られた胎児から、Kid遺伝子の両アリールがLoxP配列に挟まれたmKid遺伝子に組み換わったMEF(mouse embryonic fibroblast)を得た。また、レトロウイルスを用いてCreリコンビナーゼを発現させる系など、Kid遺伝子欠損細胞株を樹立するために必要な準備を整えた。同時に、Kid遺伝子欠損細胞株樹立後に発現させる目的で、Kidの各種変異体(リン酸化部位変異体、領域欠損変異体)をGFP融合タンパク質として発現させるベクターの構築を行った。