中枢神経系特異的MINT遺伝子欠損マウスの解析

1)MINT遺伝子に対するコンディショナル・ノックアウトマウスの作成(1)MINT遺伝子の全長を含むBACクローンを同定し、G418耐性遺伝子を含むターゲティング・ベクターを構築した。(2)ES細胞TT2株にエレクトロポレーション法にてターゲティング・ベクターを導入、G418存在下で培養することで相同組換え体の候補となる細胞株を単離、PCR法、サザンブロット法を用いて相同組換え体であることを確認した。(3)Creリコンビナーゼを発現するアデノウイルスを用いてG418耐性遺伝子を欠失させた細胞株を単離、PCR法、サザンブロット法を用いて相同組換え体であることを確認した。(4)相同組換え体をマウス胚に注入してキメラ・マウスを作成した。今後、得られたキメラ・マウスを野生型C57BL/6マウスに交配してコンディショナル・ノックアウト・マウスを樹立予定。2)in situ hybridization法による野生型マウス脳組織でのMINT mRNA発現分布解析MINT mRNAは脳、精巣、胸腺、脾臓に発現が確認されているが脳内における微細な発現部位は明らかにされていない。In situ hybridization法に用いることができるプローブを作成し、予備的ではあるが、脊髄、後根神経節、大脳皮質等に発現を確認した。3)抗MINTポリクローナル抗体の作成大腸菌を用いてGST融合タンパク質としてマウスMINT蛋白の一部を大量発現した。今後、ラビットに免疫することでポリクローナル抗体を作成する。

1)MINT遺伝子に対するコンディショナル・ノックアウトマウスの作成(1)MINT遺伝子の全長を含むBACクローンを同定し、G418耐性遺伝子を含むターゲティング・ベクターを構築した。(2)ES細胞TT2株にエレクトロポレーション法にてターゲティング・ベクターを導入、G418存在下で培養することで相同組換え体の候補となる細胞株を単離、PCR法、サザンブロット法を用いて相同組換え体であることを確認した。(3)Creリコンビナーゼを発現するアデノウイルスを用いてG418耐性遺伝子を欠失させた細胞株を単離、PCR法、サザンブロット法を用いて相同組換え体であることを確認した。(4)相同組換え体をマウス胚に注入してキメラ・マウスを作成した。今後、得られたキメラ・マウスを野生型C57BL/6マウスに交配してコンディショナル・ノックアウト・マウスを樹立予定。2)in situ hybridization法による野生型マウス脳組織でのMINT mRNA発現分布解析MINT mRNAは脳、精巣、胸腺、脾臓に発現が確認されているが脳内における微細な発現部位は明らかにされていない。In situ hybridization法に用いることができるプローブを作成し、予備的ではあるが、脊髄、後根神経節、大脳皮質等に発現を確認した。3)抗MINTポリクローナル抗体の作成大腸菌を用いてGST融合タンパク質としてマウスMINT蛋白の一部を大量発現した。今後、ラビットに免疫することでポリクローナル抗体を作成する。