高分子物質の結合と分解に関わるタンパク質・酵素の機能を規定する動的高次構造の解析

分析动态高阶结构，定义参与聚合物结合和分解的蛋白质和酶的功能

• 批准号: 15780053
• 负责人: 橋本 渉
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15780053/
• 关键词: Bacillus; キサンタンリアーゼ; X線結晶構造解析; 多糖リアーゼファミリー; ヒアルロン酸リアーゼ; コンドロイチンリアーゼ; 反応機構; 動的構造; スフィンゴモナス属細菌; 高分子物質; アルギン酸結合タンパク質; アルギン酸リアーゼ; 動的高次構造; ドメイン開閉; ループ開閉

高分子物質(キサンタン)の分解に関わるBacillus属細菌(GL1株)由来キサンタンリアーゼ(XLY)の構造機能解析を行い、以下のことを明らかにしてきた。XLYは、一次構造に基づいて多糖リアーゼファミリーPL-8に分類される。XLYのX線結晶構造(α5/α5バレル+逆並行βシート)を決定し、XLYが同じPL-8酵素の連鎖球菌ヒアルロン酸リアーゼ(HLY)やコンドロイチンリアーゼ(CLY)と同様の基本骨格を示すことを明らかにした。また、XLY、CLY、及びHLYの活性部位付近の微細な構造が極めて類似していることも見出し、XLYの触媒反応に関わる分子機構を解析することにより、PL-8酵素に共通の触媒反応機構を提示できると考えられた。XLY,HLY,CLYに共通する高次構造に基づき、触媒に直接関与すると考えられたXLYのN194、H246、Y255の部位特異的変異体を作製し、各変異体の酵素学的性質を調べた。N194A、H246A、Y255Fはいずれも野生型に比して活性が1/500以下に低下したことから、これらの3残基がXLYの活性発現に重要であることが示された。このことはPL-8酵素には共通の触媒反応機構があることを支持する結果である。活性低下型変異体であるN194Aのリガンド非結合型、生成物(ピルビン酸マンノース)結合型、及び基質[キサンタン構成最小ユニット(5糖)]結合型の結晶構造を、それぞれ、2.3、1.8、及び2.1Å分解能で決定した。得られた高次構造に基づき、Y255が酸触媒・塩基触媒として機能する触媒反応機構を提唱した。XLYの触媒反応機構は、これまでHLYの構造に基づいて提唱されていたものとは異なり、むしろCLYにおいて提唱されたものと類似していた。PL-8酵素における共通の高次構造や触媒残基の知見から、XLY及びCLYに見られる触媒反応機構がPL-8酵素に共通するものであることが強く示唆された。また、リガンド結合によりα5/α5バレルドメインの動的構造変化が認められたことから、今後触媒反応におけるドメインの動的機構を明らかにする。

Polymer material (キ サ ン タ ン) の decomposition に masato わ る Bacillus genus bacteria (GL1 strains) origin キ サ ン タ ン リ ア ー ゼ (XLY) の tectonic line function analytical を い, the following の こ と を Ming ら か に し て き た. XLY される, primary structure に base づ て て て polysaccharide リア ゼファ ゼファ リ リ リ PL-8に classification される. XLY の X-ray crystal structure (alpha 5 / alpha バ レ ル + inverse parallel beta シ ー ト) を decided し, XLY が の chain with じ PL - 8 enzyme aureus ヒ ア ル ロ ン acid リ ア ー ゼ (HLY) や コ ン ド ロ イ チ ン リ ア ー ゼ (CLY) と with others in basic skeleton の を shown す こ と を Ming ら か に し た. ま た, XLY, CLY, and び HLY の active site pay nearly の imperceptible な tectonic が extremely め て similar し て い る こ と も see し, XLY の catalyst against 応 に masato わ る molecular institutions を parsing す る こ と に よ り, PL - 8 enzymes に の common catalyst を 応 authorities suggest で き る と exam え ら れ た. Common XLY, HLY, CLY に す る high secondary tectonic に base づ き, catalytic に masato directly and す る と exam え ら れ た XLY の N194, H246, Y255 の site specific - variant を し, the different properties of 1 - learn の enzyme を adjustable べ た. N194A, H246A, Y255F は い ず れ も wild-type に than し が て activity under 1/500 low に し た こ と か ら, こ れ ら の 3 residues が XLY の active 発 に now important で あ る こ と が shown さ れ た. <s:1> <s:1> と に PL-8 enzyme に に common <s:1> catalyst anti-応 institution がある とを とを support する result である. Low activity of type - variant で あ る N194A の リ ガ ン ド the combination type, and products (ピ ル ビ ン acid マ ン ノ ー ス) combined with type, and び matrix [キ サ ン タ ン constitute A minimum ユ ニ ッ ト (5) sugar] combination type の crystallization structure を, そ れ ぞ れ, 2.3, 1.8, and 2.1 A び decomposition can で decision し た. Have ら れ た high secondary tectonic に base づ き, Y255 が acid catalyst, salt base catalyst と し て function す る catalyst を 応 authorities to sing し た. XLY の catalyst は 応 authorities, こ れ ま で HLY の に basis づ い て mention sing さ れ て い た も の と は different な り, む し ろ CLY に お い て mention sing さ れ た も の と similar し て い た. PL - 8 enzyme に お け る の common higher order structure や catalyst residue の knowledge か ら, XLY and び CLY に see ら れ る catalyst が PL 応 authorities - 8 common enzyme に す る も の で あ る こ と が く and shown strong sucking さ れ た. ま た, リ ガ ン ド combining に よ り alpha 5 / alpha バ レ ル ド メ イ ン の dynamic structural variations of が recognize め ら れ た こ と か ら, catalyst in the future the 応 に お け る ド メ イ ン の dynamic institutions を Ming ら か に す る.

项目成果

Molecular identification and characterization of an alginate-binding protein on the cell surface of Sphingomonas sp A1

• DOI: 10.1016/j.bbrc.2004.07.184
• 发表时间: 2004-09-24
• 期刊: BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS
• 影响因子: 3.1
• 作者: He, JS;Nankai, H;Murata, K
• 通讯作者: Murata, K

Wataru Hashimoto: "Crystal structure of Bacillus sp. GL1 xanthan lyase, which acts on the side chains of xanthan"Journal of Biological Chemistry. 278(9). 7663-7673 (2003)

Wataru Hashimoto：“作用于黄原胶侧链的芽孢杆菌属 GL1 黄原胶裂解酶的晶体结构”生物化学杂志。

Crystal structure of unsaturated glucuronyl hydrolase, responsible for the degradation of glycosaminoglycan, from Bacillus sp.GL1 at 1.8Å resolution

芽孢杆菌属 GL1 中负责降解糖胺聚糖的不饱和葡萄糖醛酸水解酶的晶体结构，分辨率为 1.8Å

• 发表时间: 2004
• 期刊: Journal of Biological Chemistry 279(30)
• 作者: Wataru Hashimoto;Jinshan He;Takafumi Itoh
• 通讯作者: Takafumi Itoh

Masayuki Yamasaki: "Crystallization and preliminary X-ray analysis of alginate lyase, a member of polysaccharide lyase family PL-7, from Pseudomonas aeruginosa"Acta Crystallographica setion D. 59. 1499-1501 (2003)

Masayuki Yamasaki：“来自铜绿假单胞菌的藻酸盐裂解酶（多糖裂解酶家族 PL-7 的成员）的结晶和初步 X 射线分析”Acta Crystallographa 第 D. 59. 1499-1501 (2003)

Proteomics-based identification of outer-membrane proteins responsible for import of macromolecules in Sphingomonas sp.A1 : alginate-binding flagellin on the cell surface

基于蛋白质组学的鞘氨醇单胞菌 A1 负责输入大分子的外膜蛋白的鉴定：细胞表面的藻酸盐结合鞭毛蛋白

• 发表时间: 2005
• 期刊: Biochemistry 44・42
• 作者: Wataru Hashimoto