緑膿菌エコーシステムにおけるバイオフィルムの酵素・遺伝学的特性解析とその応用

铜绿假单胞菌回声系统中生物膜的酶学和遗传表征及其应用

• 批准号: 13760067
• 负责人: 橋本 渉
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13760067/
• 关键词: エコーシステム; バイオフィルム; 緑膿菌; アルギン酸; アルギン酸リアーゼ; ポリリン酸キナーゼ; 運動性; Sphingomonas属細菌

バイオフィルム(BF)は、微生物の重要な生存様式(エコーシステム)であるが、その系の複雑さのために充分な解析が進んでいない。運動性を有する緑膿菌は、菌体外に多糖アルギン酸を分泌し、これをBFとして周囲から隔離された生存様式を示し、時には重篤な呼吸器疾患を発症する。さらに、BFを分解し遊離することにより、新たな部位へ移動する。BF形成に関わる緑膿菌の運動性には、ポリリン酸キナーゼ(PPK)により合成されるポリリン酸の関与が指摘されている。緑膿菌はペリプラズムにアルギン酸分解酵素(AlgL)を有するが、その遺伝子はアルギン酸合成遺伝子群と同一オペロンに存在している。AlgLの遺伝子と活性発現との相関が不明なため、AlgLの生理的意義とBF分解制御は殆ど未知である。そこで本研究では、緑膿菌BFに焦点を当て、特にPPKとAlgLが各々関わるBF形成及び分解制御機構を明らかにすることを目的とする。AlgL大量発現大腸菌(全タンパク質の約30%)を育種し、精製系を確立した。AlgLは、これまでに当研究室で構造機能相関を明らかにしているSphingomonas属細菌由来の酵素A1-IIIと有意な相同性(30%)を示した。A1-IIIの触媒残基に相当するAlgLのHis202及びTyr256を各々Ala及びPheに置換した変異体は、酵素活性を示さなかった。従って、His202及びTyr256は、AlgLの活性発現に必須であることが明らかになった。今回、同定した触媒残基の知見に基づいて、緑膿菌ゲノム上のAlgL遺伝子に変異を導入することにより、アルギン酸合成系を修飾することなく、AlgLの機能のみを欠失させた変異株の作製が可能となる。今後、本変異株を用いて、BF分解制御機構を解析する。また、運動性を制御するPPKの構造機能相関を明らかにするため、蒸気拡散法を用いたPPKの結晶化を行っている。

The important survival formula of microorganisms (BF) is fully analyzed. The activity of Pseudomonas aeruginosa is related to the secretion of polysaccharide and acid in vitro, the isolation of BF and other biological factors, and the development of respiratory diseases The new part of the body moves. BF formation is related to the mobility of Pseudomonas aeruginosa, and the synthesis of Pseudomonas aeruginosa (PPK). Pseudomonas aeruginosa is a member of the same group of enzymes known as alginase (AlgL). AlgL's biological significance, BF decomposition and control are unknown. In this study, the focus of Pseudomonas aeruginosa is on the formation and decomposition of BF. A large number of E. coli strains (about 30% of the total quality) were found in AlgL, and breeding and purification systems were established. AlgL showed significant identity (30%) to enzymes A1-III of Sphingomonas origin when the structure and function of the laboratory were related. AlgL, His202 and Tyr256 are the corresponding catalytic residues of A1-III. Ala and Phe are substituted for each other, and enzyme activity is demonstrated. His202 and Tyr256 are essential for AlgL activity. In this paper, the basic knowledge of the same catalyst residue, the introduction of different AlgL genes on Pseudomonas aeruginosa, the modification of the acid synthesis system, the lack of function of AlgL, and the possible production of different strains. In the future, this plant will be used in the analysis of BF decomposition control mechanism. The structural function of PPK is closely related to its mobility, and the crystallization of PPK is carried out by evaporation method.

项目成果

Wataru Hashimoto: "Crystal structure of Bacillus sp. GL1 xanthan lyase, which acts on the side chains of xanthan"Journal of Biological Chemistry. (In press). (2003)

Wataru Hashimoto：“作用于黄原胶侧链的芽孢杆菌属 GL1 黄原胶裂解酶的晶体结构”生物化学杂志。

Yumiko Mishima: "Crystal structure of AlgQ2, a macromolecule (alginate)-binding protein of Sphingomonas sp. A1, complexed with an alginate tetrasaccharide at 1.6Å resolution"Journal of Biological Chemistry. (In press). (2003)

Yumiko Mishima：“AlgQ2 的晶体结构，一种鞘氨醇单胞菌 A1 的大分子（藻酸盐）结合蛋白，与藻酸盐四糖以 1.6Å 分辨率复合”《生物化学杂志》（2003 年）。

Wataru Hashimoto: "Polysaccharide lyase : molecular cloning, sequencing, and overexpression of the xanthan lyase gene of Bacillus sp.strain GL1"Applied and Environmental Microbiology. 67・2. 713-720 (2001)

Wataru Hashimoto：“多糖裂解酶：芽孢杆菌菌株GL1的黄原胶裂解酶基因的分子克隆、测序和过度表达”应用和环境微生物学67・2（2001）。

Keiko Momma: "Crystal structure of AlgQ2, a macromolecule (alginate)-binding protein of Sphingomonas sp. A1 at 2.0Å resolution"Journal of Molecular Biology. 316(5). 1051-1059 (2002)

Keiko Momma：“AlgQ2 的晶体结构，一种鞘氨醇单胞菌 A1 的大分子（藻酸盐）结合蛋白，分辨率为 2.0Å”《分子生物学杂志》316(5) (2002)。

Hye-Jin Yoon: "Effect of His192 mutation on the activity of alginate lyase A1-III from Sphingomonas species A1"Journal of Microbiology and Biotechnology. 11(1). 118-123 (2001)

Hye-Jin Yoon：“His192 突变对鞘氨醇单胞菌 A1 种藻酸盐裂解酶 A1-III 活性的影响”微生物学和生物技术杂志。