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遺伝子工学的手法を用いたグース型リゾチームの触媒機構の解明

利用基因工程方法阐明鹅型溶菌酶的催化机制

基本信息

批准号：
15780077
负责人：
河村俊介
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Kyushu Tokai University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

グース型リゾチームはニワトリ形リゾチームと比較して極めて研究が遅れており,その触媒機構や基質結合様式等殆ど明らかでない.グース卵白リゾチーム(GEL)のX線解析からは,Glu73が触媒基であると予測されているが,その証明はなされていない.平成16年度においては,ダチョウ卵白由来グース型リゾチーム(OEL)のGlu73をGln, Asp, Alaに置換した変異体(E73Q,E73D,E73A)の酵素学的性質を調べた.各変異体の溶菌活性を測定した結果,E73QとE73Aは活性を完全に消失し,E73Dでは約9%にまで活性が低下した.この活性測定の結果は,N-アセチルグルコサミンの5量体と6量体を用いて活性測定を行った結果とも一致し,またE73Dの反応タイムコースの反応生成物の量は野生型酵素と同じであった.これらの変異体の基質結合力やCDスペクトルには変化が無いことから,グース型リゾチームのGlu73はプロトンドナーとして働く触媒基であることが証明できた.興味深いことに,Alaに置換した変異体E73Aは,酵母での発現量が極端に低下し,変性剤であるグアニジン塩酸に対する熱力学的安定性が大きく低下したグース型リゾチームの立体構造から,分子内部に位置する3つのヘリックス(H5,H7,H8)がコアー構造を形成し,タンパク質の構造維持に寄与していることが予測されている.触媒基Glu73はH5に位置し,その側鎖のカルボキシル基はH8に位置し種間で完全に保存されているTyr169の側鎖の水酸基と水素結合を形成している.したがって,グース型リゾチームのGlu73は,触媒基としての働きだけでなく,タンパク質の安定性やフォールディングにも重要な働きを有することが明らかとなった.この結果は,Tyr169をAlaに置換した変異体の発現量や安定性が大きく低下することからも証明された.さらに本年度では,ダース型リゾチームで完全に保存されている2つのS-S結合の役割についても検討した.Cys残基をSerに置換した変異体を作製し,活性および安定性を調べた.その結果,グース型リゾチームの活性や基質結合力には変化が無かったものの,安定性が大きくした.したがって,2つのS-S結合は,構グース型リゾチームの安定性および構造維持に重要であることが明らかとなった.

The research on catalyst mechanism and matrix binding model is very important. X-ray analysis of the GEL shows that Glu73 is a catalyst group. In the 16th year of Heisei, the origin of protein was changed from type to type (OEL) and Glu73 to Gln, Asp, Ala to substitution (E73Q, E73D, E73A). E73Q and E73A showed no activity at all, while E73D showed A low activity of about 9%. The results of this activity assay were consistent with those of the 5-and 6-quantity-based assays, and the amounts of the products of the E73D enzyme were the same as those of the wild-type enzyme. The binding force of different kinds of substrates is CD, CD In addition, the thermodynamic stability of yeast is greatly reduced due to the substitution of Ala with different E73A. The three-dimensional structure of yeast is formed due to the position of Ala (H5,H7,H8) within the molecule, and the structure of yeast is maintained due to the prediction. The catalyst group Glu73 is located at H5, and the side chain of the catalyst group Glu 73 is located at H8. The catalyst group Glu 73 is completely preserved between species. In addition, the Glu73 of the catalyst base is very important for the stability of the catalyst base. The results show that Tyr169 Ala is a substitution for Tyr169 Ala, and that the stability of Tyr 169 Ala is very low. In the current year, the S-S bond was completely preserved. The Cys residue was replaced by Ser and the activity and stability were adjusted. As a result, the activity and matrix binding force of the active matrix changed greatly, and the stability increased greatly. The stability and structural maintenance of S-S bond structure are important.