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質量分析を用いたトビイカ発光タンパクの動的変化に関する研究

质谱法研究鱿鱼发光蛋白的动态变化

基本信息

批准号：
15780085
负责人：
久世雅樹
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

発光タンパク質シンプレクチンをアジド化デヒドロセレンテラジンで光標識しても、標識ペプチドの質量分析による特定は困難であった。これはシンプレクチンの全ペプチド断片を一度に解析していたためと考えられる。そこで、光標識した後、遊離のシステイン残基をすべてアルキル化し、次いでブロモシアンをもちいて大きなフラグメント(数千ダルトン以上)と分解して、電気泳動により蛍光性のフラグメントを特定することとした。アジド基のみならず、ジアゾアセチル基をもつデヒドロセレンテラジンも合成した。これらの光親和性標識化合物について、エクオリンを用いて標識したところ効率よく標識できたことが判明した。光標識されたペプチドのみを簡便に精製できる官能基をもつデヒドロセレンテラジン誘導体も新規に合成することとした。ストレッカー反応を鍵反応として数段階にて効率よく様々な誘導体を合成できる新規ルートの確立に成功した。つぎに、シンプレクチンの活性部位における、デヒドロセレテラジン類の構造活性相関についての研究を行った。その結果、疎水性の置換基がデヒドロセレンテラジンの6位に導入されると、発光活性が著しく低下することが分かった。ジアゾアセチル-デヒドロセレンテラジンにより、電気泳動とゲル濾過カラムの操作を省くことが可能となり、標識条件を種々検討できるようになった。標識した後、デヒドロセレンテラジン部分をビオチン基に置き換え、光標識されたペプチド断片のみがアビジンカラムに吸着されるので、溶出させるときにオンラインで蛍光検出ナノ-HPLCに接続し、Q-TOF-MSおよびMS/MS測定し光標識部位を解析する手法が確立できた。

The quality analysis of the optical label and the identification of the optical label are difficult to achieve. All of the above are analyzed. In addition, after the identification of light, the free protein residues are separated from each other, and the secondary protein residues are separated from each other. In addition, after the identification of light, the free protein residues are separated from each other, and the secondary protein residues are separated from each other. In addition, after the identification of light, the free protein residues are separated from each other, and the secondary protein residues are separated from each other. The base of the search engine is closed, the base of the search engine is closed, and the search engine is closed. The photoaffinity identification compound is identified by the identification rate. The optical label is easy to refine, and the functional group is easy to synthesize. A new method of synthesis is proposed. The research on the structure activity correlation between the active site and the active site of the protein was carried out. As a result, the substitution group of the aqueous phase was introduced into the 6-position of the protein, and the photoactivity was reduced. The operation of the electrokinetic filter is possible, and the identification conditions are discussed. After identification, the identification part is replaced by the base, the optical identification part is replaced by the absorption part, the dissolution part is replaced by the optical identification part, and the optical identification part is analyzed by Q-TOF-MS and MS/MS.