光親和性標識法によるトビイカ発光タンパクの活性部位の動的解析

利用光亲和标记动态分析鱿鱼发光蛋白的活性位点

基本信息

批准号：
17780090
负责人：
久世雅樹
金额：
$ 1.73万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

光親和性アジド化デヒドロセレンテラジン(Az-F-DCL)を、活性中心探索プローブとして様々な発光タンパク質でも利用できることを確認するために以下の検討を行った。セレンテラジン系化合物を利用する発光タンパク質として、トビイカ発光タンパク質シンプレクチン、オワンクラゲ発光タンパク質エクオリン、そしてホタルイカルシフェラーゼの3つについて、Az-F-DCLを用いて光標識実験を行った。光照射と、加水分解酵素によるペプチド断片への消化、そして光照射生成物の消化物の質量分析による解析と順次行ったが、光照射部位の特定は容易ではなかった。これは、光照射の効率が高くないことに由来していることが考えられた。そこで、光照射条件を最適化することとした。まず、トリフルオロエタノール(TFE)中で、Az-F-DCLよりも構造をシンプルにした芳香族アジド化合物を数種類合成し、光照射生成物を様々な条件で分析した。生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析したところ、高圧水銀灯(365nm)よりも低圧水銀灯(254nm)を用いて照射する方がより効率的に溶媒と結合することが判明した。これまで、アジド化合物がすべて消費するまで光照射していたが、これでは、生成物も壊れてしまうことが判明した。しかも、アジド分解物である中間体ニトレンより生成するアゼピン化合物を利用してタンパク質を標識する方が良いことも判明した。これまで、ニトレン中間体を用いて挿入反応によりタンパク標識を試みてきたが、アゼピン化合物へとタンパクを誘導する方法を用いることで、光照射の効率が向上できることが明らかとなった。

进行以下研究以确认光亲和力叠氮化脱氢丙嗪（AZ-F-DCL）可用于多种发光蛋白作为活性中心搜索探针。使用AZ-F-DCL对三种利用鞘嗪化合物的三种光蛋白进行了光标记实验：鱿鱼光蛋白简称蛋白，水母光蛋白源源和萤火虫钙化酶。结果是通过光照射，用水解酶酶消化成肽片段的，以及通过质谱法对光照射产物消化的分析，但并不容易识别光照射的位点并不容易。人们认为这是由于光照射效率低下所致。因此，优化了光照射条件。首先，在三氟乙醇（TFE）中合成了几种比AZ-F-DCL更简单结构的芳族叠氮化化合物，并在各种条件下分析了光照射产物。通过高性能液相色谱法分析了该产物，并发现与高压汞灯（365 nm）相比，使用低压汞灯（254 nm）的辐射更有效地与溶剂结合。到目前为止，所有叠氮化物化合物都被辐照到食用为止，但事实证明这也破坏了该产品。此外，已经发现，最好使用中间硝酸盐（是叠氮化物降解产物）产生的叶片化合物标记蛋白质。到目前为止，使用硝酸盐中间体的插入反应尝试了蛋白质标记，但已经揭示了通过使用将蛋白质诱导到阿作为氮杂化合物中的方法，可以提高光照射的效率。