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光親和性標識法によるトビイカ発光タンパクの活性部位の動的解析

利用光亲和标记动态分析鱿鱼发光蛋白的活性位点

基本信息

批准号：
17780090
负责人：
久世雅樹
金额：
$ 1.73万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

光親和性アジド化デヒドロセレンテラジン(Az-F-DCL)を、活性中心探索プローブとして様々な発光タンパク質でも利用できることを確認するために以下の検討を行った。セレンテラジン系化合物を利用する発光タンパク質として、トビイカ発光タンパク質シンプレクチン、オワンクラゲ発光タンパク質エクオリン、そしてホタルイカルシフェラーゼの3つについて、Az-F-DCLを用いて光標識実験を行った。光照射と、加水分解酵素によるペプチド断片への消化、そして光照射生成物の消化物の質量分析による解析と順次行ったが、光照射部位の特定は容易ではなかった。これは、光照射の効率が高くないことに由来していることが考えられた。そこで、光照射条件を最適化することとした。まず、トリフルオロエタノール(TFE)中で、Az-F-DCLよりも構造をシンプルにした芳香族アジド化合物を数種類合成し、光照射生成物を様々な条件で分析した。生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析したところ、高圧水銀灯(365nm)よりも低圧水銀灯(254nm)を用いて照射する方がより効率的に溶媒と結合することが判明した。これまで、アジド化合物がすべて消費するまで光照射していたが、これでは、生成物も壊れてしまうことが判明した。しかも、アジド分解物である中間体ニトレンより生成するアゼピン化合物を利用してタンパク質を標識する方が良いことも判明した。これまで、ニトレン中間体を用いて挿入反応によりタンパク標識を試みてきたが、アゼピン化合物へとタンパクを誘導する方法を用いることで、光照射の効率が向上できることが明らかとなった。

The following discussion was conducted on the photoaffinity of the enzyme (Az-F-DCL), the activity center, and the quality of the enzyme. The use of Celentiran-based compounds has been implemented in three aspects: the light-emitting substance, the Tvirika light-emitting substance, the Owirika light-emitting substance, the Sistirika light-emitting substance, and the Az-F-DCL light-emitting label. Light irradiation, hydrolysis enzyme digestion, and light irradiation product quality analysis, sequential analysis, light irradiation site identification This is the reason why the rate of light irradiation is so high. Optimization of light irradiation conditions The structure of Az-F-DCL in TFE was analyzed under the conditions of synthesis of several aromatic compounds and light irradiation products. The product is high speed liquid crystal analysis, high pressure mercury lamp (365nm) or low pressure mercury lamp (254nm). This is the first time that a chemical compound has been identified by light irradiation. The quality of the product can be determined by the following methods: For example, the intermediate can be used in the process of reaction, identification, and induction.