メキシコイトスギ培養細胞におけるヒノキチオール生成経路と関与する酵素

墨西哥柏树培养细胞中桧醇的产生途径和酶

基本信息

批准号：
15780127
负责人：
藤田弘毅
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究者はテルペンシンターゼによりゲラニル二リン酸からテルピノレンを合成し、さらに修飾を受けてヒノキチオールが生産されると予想している。この予想に基づき、C.lusitanica細胞に存在するヒノキチオール生産関連酵素の探索を行った。まず、テルペンシンターゼのクローニングを試みた。既知のテルペンシンターゼのcDNA配列を参考にホモロジーを用いたdegenerateRT-PCRにて対象遺伝子の断片を得た。このRT-PCR産物のDNA配列は従来のテルペンシンターゼに十分なホモロジーを持っていたので、これをもとにcDNAライブラリーからのテルピノレンシンターゼのスクリーニングを行った。このプローブによって、いくつかのクローンが得られた。しかしながら、すべてのクローンは5‘末端の配列を欠いていたので、5'-RACE法を用い、欠損部分を補うことで全長配列を得た。この全長配列はすべて既知針葉樹テルペンシンターゼと十分に相同性を持つことが示された。大腸菌によるこの酵素の生産のためにはシグナルペプチドの切除が必要なため、適宜5'側配列を削った状態でこれらを遺伝子導入し、異種発現させ、誘導タンパクを得た。しかしながら、現在のところこのタンパクに酵素活性を得るには至っていない。一方で、本細胞内にあるモノテルペン類の探索から、炭化水素モノテルペンのP450酵素による代謝に興味が持たれた。そこで、ヒノキチオール生産の中間体と予想しているテルピノレンの粗酵素液による変換について調べた。一般的な植物P450の抽出・反応に使われる条件でC.lusitanica細胞粗酵素抽出液ミクロソーム画分を用いてテルピノレンを基質としたところ、生成物として5-Isopropylidene-2-methyl-cyclohex-2-enolが得られた。これが、さらに酸化・変換を受けてヒノキチオールとなる物と予想している。

研究人员预测，萜烯将通过萜烯合酶从Geranyldiphosphate合成，并将进行进一步的修改以产生hinokithiol。基于这个预测，我们搜索了与卢西塔梭菌细胞中hinokithiol生产有关的酶。首先，尝试了萜烯合酶。使用已知萜烯合酶的cDNA序列通过Degeneratert-PCR获得靶基因的片段。该RT-PCR产物的DNA序列具有足够的常规萜烯合酶的同源性，因此，基于此，从cDNA文库中筛选了萜烯合酶的萜烯合酶。该探针提供了几个克隆。但是，由于所有克隆都缺乏5'末端序列，因此使用5'race方法来补偿缺失部分，从而获得了全长序列。所有这些全长序列均显示出与已知的针叶萜合酶的充分同源性。由于信号肽是通过大肠杆菌生产该酶所需的，因此根据适当去除的5'序列转移基因，因此获得异源表达以获得诱导的蛋白质。然而，目前，该蛋白质尚未实现酶活性。另一方面，在该细胞中搜索单二烯引起了P450酶对碳氢化合物单苯甲酸的代谢的兴趣。因此，我们研究了萜酚的转化，预计该转化是通过粗酶溶液在Hinokithiol生产中的中间体。在用于提取和反应植物P450的条件下，将萜醇用作底物作为底物，使用Lusitanica细胞粗酶粗酶提取物的微粒体分数，以及5-异丙烯-2-甲基二甲基 - 甲基环氟hex-2-烯醇作为产物获得。我们希望这将进一步氧化并转化为Hinokithiol。