メキシコイトスギ培養細胞におけるヒノキチオール生成経路と関与する酵素

墨西哥柏树培养细胞中桧醇的产生途径和酶

• 批准号: 15780127
• 负责人: 藤田 弘毅
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15780127/
• 关键词: ヒノキチオール; β-thujaplicin; Cupressus lusitanica; テルペン生合成; 植物組織培養; 共役七員環; マクロアレイ法; P450; beta-thujaplicin

本研究者はテルペンシンターゼによりゲラニル二リン酸からテルピノレンを合成し、さらに修飾を受けてヒノキチオールが生産されると予想している。この予想に基づき、C.lusitanica細胞に存在するヒノキチオール生産関連酵素の探索を行った。まず、テルペンシンターゼのクローニングを試みた。既知のテルペンシンターゼのcDNA配列を参考にホモロジーを用いたdegenerateRT-PCRにて対象遺伝子の断片を得た。このRT-PCR産物のDNA配列は従来のテルペンシンターゼに十分なホモロジーを持っていたので、これをもとにcDNAライブラリーからのテルピノレンシンターゼのスクリーニングを行った。このプローブによって、いくつかのクローンが得られた。しかしながら、すべてのクローンは5‘末端の配列を欠いていたので、5'-RACE法を用い、欠損部分を補うことで全長配列を得た。この全長配列はすべて既知針葉樹テルペンシンターゼと十分に相同性を持つことが示された。大腸菌によるこの酵素の生産のためにはシグナルペプチドの切除が必要なため、適宜5'側配列を削った状態でこれらを遺伝子導入し、異種発現させ、誘導タンパクを得た。しかしながら、現在のところこのタンパクに酵素活性を得るには至っていない。一方で、本細胞内にあるモノテルペン類の探索から、炭化水素モノテルペンのP450酵素による代謝に興味が持たれた。そこで、ヒノキチオール生産の中間体と予想しているテルピノレンの粗酵素液による変換について調べた。一般的な植物P450の抽出・反応に使われる条件でC.lusitanica細胞粗酵素抽出液ミクロソーム画分を用いてテルピノレンを基質としたところ、生成物として5-Isopropylidene-2-methyl-cyclohex-2-enolが得られた。これが、さらに酸化・変換を受けてヒノキチオールとなる物と予想している。

The researchers は テ ル ペ ン シ ン タ ー ゼ に よ り ゲ ラ ニ ル two リ ン acid か ら テ ル ピ ノ レ ン を synthetic し, さ ら に modified を by け て ヒ ノ キ チ オ ー ル が production さ れ る と to think し て い る. The <s:1> <s:1> is associated with the に base づ に, and C.lusitanica cells に exist in the するヒノキチ and <s:1> に production of enzymes related to the った. Explore the を line った. ま ず, テ ル ペ ン シ ン タ ー ゼ の ク ロ ー ニ ン グ を try み た. Both know の テ ル ペ ン シ ン タ ー ゼ の cDNA match column を reference に ホ モ ロ ジ ー を with い た degenerateRT - PCR に て like heritage seaborne 伝 son た の を fragment. こ の rt-pcr product の DNA match column は 従 to の テ ル ペ ン シ ン タ ー ゼ に very な ホ モ ロ ジ ー を hold っ て い た の で, こ れ を も と に cDNA ラ イ ブ ラ リ ー か ら の テ ル ピ ノ レ ン シ ン タ ー ゼ の ス ク リ ー ニ ン グ を line っ た. Youdaoplaceholder5 プロ プロ ブによって ブによって, く く ロ ロ ロ ロ ロ が が られた られた. し か し な が ら, す べ て の ク ロ ー ン は 5 'end の match column を owe い て い た の で, 5' - RACE method を い, fill owe damaged part を う こ と で span arrangement を た. こ の span arrangement は す べ て already know conifer テ ル ペ ン シ ン タ ー ゼ と very に identity を hold つ こ と が shown さ れ た. Coliform に よ る こ の の enzyme production の た め に は シ グ ナ ル ペ プ チ ド の excision が necessary な た め, suitable for 5 'を "cross-draw column cut っ た state で こ れ ら を heritage 伝 import し, heterogeneous 発 now さ せ, induced タ ン パ ク を た. し か し な が ら, now の と こ ろ こ の タ ン パ ク に enzyme active を る に は to っ て い な い. Party で, the intracellular に あ る モ ノ テ ル ペ ン explore such の か ら, coking water element モ ノ テ ル ペ ン の P450 enzyme に よ る metabolic に tumblers が hold た れ た. そ こ で, ヒ ノ キ チ オ ー ル の intermediates production と to think し て い る テ ル ピ ノ レ ン の thick enzyme fluid に よ る variations in に つ い て adjustable べ た. General な plant P450 の extraction, reverse 応 に make わ れ る conditions で C.l usitanica cells crude enzyme extract ミ ク ロ ソ ー ム を draw points with い て テ ル ピ ノ レ ン を matrix と し た と こ ろ, products と し て 5 - Isopropylidene - 2 - methyl - 2 - enol cyclohex - が Get られた. Youdaoplaceholder2 れが and さらに acidify and change を under the influence of けてヒノキチ <s:1> となる となる となる となる となる substances と to て て る る る.

项目成果

Zhao J et al.: "Involvement of cAMP signaling in elicitor-induced phytoalexins accumulation in Cupressus lusitanica cell cultures"New phytologist. 161,3. 723-773 (2004)

赵杰等人：“Cupressus lusitanica 细胞培养物中 cAMP 信号传导参与诱导子诱导的植物抗毒素积累”新植物学家。

Matsunaga et al.: "Monoterpenes produced by Cupressus lusitanica cultured cells including a novel monoterpene (1s,2S,6S)-(+)-1,6-epoxy-4(8)-p-menthen-2-ol"Natural product research. 17,6. 441-443 (2003)

Matsunaga等人：“由Cupressus lusitanica培养细胞产生的单萜，包括一种新型单萜(1s,2S,6S)-( )-1,6-epoxy-4(8)-p-menthen-2-ol”天然产物研究

Jasmonate and ethylene signalling and their interaction are integral parts of the elicitor signalling pathway leading to β-thujaplicin biosynthesis in Cupressus lusitanica cell cultures

茉莉酸和乙烯信号传导及其相互作用是诱导子信号传导途径的组成部分，导致柏木细胞培养物中 β-thujaplicin 的生物合成

• 发表时间: 2004
• 期刊: JOURNAL OF EXPERIMENTAL BOTANY 55(399)
• 作者: Zhao J;Zheng SH;Fujita K;Sakai K.
• 通讯作者: Sakai K.