ルーメン細菌の効率的な検出のためのマルチプレックスPCR法の確立

高效检测瘤胃细菌的多重PCR方法的建立

• 批准号: 15780177
• 负责人: 田島 清
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: National Agricultural Research Organization
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15780177/
• 关键词: ルーメン細菌; マルチプレックスPCR

昨年度作成したマルチプレックスPCRでは、5反応で17菌種の検出が可能であったが、実際のルーメン内容物由来DNAを用いて行った検出では、感度がシンプレックスPCRよりも劣ったため、本年度はこれと同等の感度を持たせること、ならびに精度向上を目的に、再度条件検討を行った。R.productus、C.proteoclasticumの2菌種を検出するプライマーが他の菌種でも反応することが見出されたため、新たにプライマーを設計し直した。各標的菌種ごとに温度勾配PCRにより至適アニール温度を決定し、リアルタイムPCRによる増幅曲線から至適マグネシウム濃度を決定した。増幅サイズとの上記データをもとにマルチプレックスPCRでの検出菌種の組み合わせを決定した。その結果、6反応で17菌種の検出が可能だった。マルチプレックスPCRでの検出は反応液中に標的菌種のDNAが150pg含まれていれば可能であり、シンプレックスPCRと同様の感度だった。増幅産物の配列確認でも、目的とする菌種のみを増幅していることを確認した。本方法を用い、濃厚飼料給与0・3・28日目、チモシー・飼料イネの給与、暑熱環境下(20℃・28℃・33℃)飼育、プロトゾアの有無のルーメン内容物由DNAを用いて検出の差を求めたところ、各サンプル間でシンプレックスでの検出と同様の差を認めた。暑熱環境下飼育のものは定量的PCR法により繊維分解菌3種の定量を行い、環境温度の上昇に応じて繊維分解菌数が低下することが明らかになった。

Last year's PCR was created to detect 17 species, and the results showed that the detection of DNA was possible. This year's PCR was created to detect the same sensitivity, and the results showed that the detection of DNA was accurate. R.productus, C.proteoclasticum and other species. The temperature of each target species is determined by PCR amplification curve from temperature to temperature. To determine the composition of the species identified by PCR The results showed that 6 of the 17 strains could be detected. The DNA of the target species detected in the PCR solution was 150pg, and the sensitivity of the PCR was similar to that of the target species. Increase in the number of species identified The method comprises the following steps of: feeding concentrated feed for 0.3.28 days; feeding; breeding under a hot environment (20 DEG C. 28 DEG C. 33 DEG C); detecting the difference between the contents of the feed and the contents of the feed by DNA; detecting the difference between the contents of the feed and the contents of the feed; and identifying the difference between the contents of the feed and the contents of the feed. The quantitative PCR method for the three kinds of vitamin decomposing bacteria was used in the breeding under the hot environment, and the number of vitamin decomposing bacteria decreased due to the increase of environmental temperature.