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相同DNA対合活性を利用した高精度マルチプレックスPCR法の確立

利用同源DNA配对活性建立高精度多重PCR方法

基本信息

批准号：
18651095
负责人：
美川務
金额：
$ 2.24万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18651095/
关键词：
バイオテクノロジーゲノム核酸

项目摘要

一検体のDNAに対して多数のPCR反応を同時に行う"マルチプレックスPCR法"が確立されればその増幅パターン解析のみで増幅元DNAの同定が可能になる.この系の確立は,医療分野における新たな検査・診断法や環境・食品分野での簡便な検定試験法への応用など,産業界に大きなインパクトを与えうる.本研究課題では,DNA相同組換えを行う酵素群を利用してPCRの初期反応を制御することにより,高精度なマルチプレックスPCR法を確立することを目的としている.平成19年度は主にRecA蛋白質の対合反応を調節しているRecF,RecO,RecR,SSB蛋白質を調製し,それらのPCR反応に対する効果を調べた.特にSSBはDNAの二次構造を緩和する性質があるため,二次構造を形成しやすいDNA領域に対する効果が期待された.しかしながら,SSBは強くPCR反応を阻害し,期待された効果は得られなかった.この問題を解決すべく,RecO,RecRの単鎖DNA上に存在するSSBに対する効果について解析したところ,1)RecOは単鎖DNA上でSSBと入れ替わること.2)入れ替わったSSBはRecOを介して単鎖DNA上に留まっていること.3)単鎖DNA上のRecOにRecRが相互作用するとRecOからSSBが解離すること.4)その結果生じたRecOR複合体はSSBで覆われた単鎖DNA上にRecAフィラメントの形成を促すことが明らかになった.これらのことから,これら蛋白質群を適した比率でPCR反応に加えることにより,これまで不可能であった高次構造を取りやすい領域のPCR増幅が可能になることが示唆された.

A 検 body の DNA にし seaborne て most の PCR anti 応を line at the same time にう "マルチプレックス PCR method" が establish されればその rights of パターン parsing のみで raised with constant amplitude yuan DNA のが may になる. この is のは, medical eset における new たな検 Charlie diagnostics や for environment, food eset での is simple な検 test method への Youdaoplaceholder0 is used in なえうる, and in the industrial field, に is large, なな, な, パ, トを and えうる. This research topic では, DNA is the same group in えを line う enzyme group of をして PCR の early against 応を suppression することにより, high-precision なマルチプレックをス PCR method established することを purpose としている. Pp.47-53 19th annual は main にの rec a protein or the seaborne 応を adjust している RecF, RecO, RecR, SSB modulation し protein を, それらの PCR anti 応にす seaborne る unseen fruit を adjustable べた. Special に SSB はの DNA secondary structure を ease する nature があるため, formation し secondary tectonic をやすい DNA field にす seaborne る unseen fruit が expect された. しかしながら, SSB はく PCR reverse 応を resistance against し, expect された fruit comes unseen はられなかった. このを solve すべく, RecO, RecR の単 lock DN A に exist on する SSB にす seaborne る unseen fruit について parsing したところ, 1) RecO は単で SSB と DNA into the lock for われること. 2) into the れ for わった SSB は RecO を interface して単 lock on the DNA に stay まっていること. 3) 単 lock on DNA の RecO に RecR が interaction すると RecO から SSB が dissociation すること. 4) その result born じた RecOR complex は SSB で fu われた単 lock DNA に rec a フィラメントの form を promote すことが Ming らかになった. これらのことから, これら protein group を optimum した ratio で PCR anti 応に plus えることにより, これまで impossible であ The increase in <s:1> PCR in the った higher-order structure を and the やすった domain が may be になるとがとが indicating された.