HCV感受性細胞IMY-N9におけるウイルスレセプター及び宿主細胞複製因子の解析

HCV増殖機構の解析はインターフェロン(IFN)療法やリバビリンによる治療のみに頼っている現況において、新たな抗ウイルス剤の開発に必須の研究である。我々はこれまで培養肝細胞株を用いたHCV複製系の開発及びin vitro transcriptを用いたHCV RNA翻訳制御機構の解析を行ってきた。HCV RNAの3'末端に保存されたX領域があり、この部位には宿主蛋白であるpolypyrimidine-tract-binding-protein(PTB)が結合し、HCV RNA翻訳増強に関与すると報告した。更にHCVにはコア蛋白領域RNAにもPTB結合部位があり、HCV RNA翻訳抑制部位となっていることも見いだした。これらの事実はHCV増殖機構に宿主細胞因子が重要であることを示している。我々は更にヒト初代培養肝細胞でHCVが複製することに着目し、HCV非感受性細胞であるHepG2細胞にヒト肝細胞を細胞融合し、得られた融合細胞の中からHCV感受性細胞株IMY-N9細胞をクローニングした。IMY-N9はHepG2細胞とヒト肝細胞の染色体全てを持ち合わせており、ヒト肝細胞のphenotypeがHCV複製に関与していることが示された。IMY-N9と親細胞であるHepG2の宿主蛋白発現レベルをGeneChipを用いて比較すると、Heparan Sulfate Proteoglycan(HSPG)コア蛋白の1つであるGlypican-3、また肝特異的転写制御因子であるHepatocyte Nuclear Factor 4(HNF-4)のmRNA levelがIMY-N9で有意に上昇していた。HSPGはHCVと同じフラビウイルスに属するデングウイルスのレセプターとして近年報告されており、HIVやサイトメガロウイルスの細胞内エントリーにも関与している。IMY-N9のHCV感受性もGlypican-3高発現による可能性も示唆され、特にレセプター機能を持つ可能性がある。RT-PCRやWestern blot法の解析でもGlypican 3やHNF-4のIMY-N9における発現増強が確認された。更にHCVレセプターと報告されているCD81発現は認めず、IMY-N9への感染は異なるレセプターを介する事が示唆された。また、Huh7細胞での複製がLemonらによって確立されているHCV subgenomic replicon(NNeo3'-5')についてIMY-N9、HepG2での複製をRNA transfectionで検討するとIMY-N9のみにコロニー形成を認めた。しかし、複製効率はHuh7より低かった。一方、Wakitaらが確立したgenotype 2a由来のHCV subgenomic replicon(JFH-1)では両者にコロニー形成を認めたが、IMY-N9での複製がHuh7、HepG2より複製高率が高かった。更にJFH-1 subgenomic repliconが複製しているIMY-N9と患者血清を用いた感染実験を行うと、培養上清中に患者血清由来のHCVがオリジナルのIMY-N9より大量に放出されることが明らかとなった。

HCV増殖機構の解析はインターフェロン(IFN)療法やリバビリンによる治療のみに頼っている現況において、新たな抗ウイルス剤の開発に必須の研究である。我々はこれまで培養肝細胞株を用いたHCV複製系の開発及びin vitro transcriptを用いたHCV RNA翻訳制御機構の解析を行ってきた。HCV RNAの3'末端に保存されたX領域があり、この部位には宿主蛋白であるpolypyrimidine-tract-binding-protein(PTB)が結合し、HCV RNA翻訳増強に関与すると報告した。更にHCVにはコア蛋白領域RNAにもPTB結合部位があり、HCV RNA翻訳抑制部位となっていることも見いだした。これらの事実はHCV増殖機構に宿主細胞因子が重要であることを示している。我々は更にヒト初代培養肝細胞でHCVが複製することに着目し、HCV非感受性細胞であるHepG2細胞にヒト肝細胞を細胞融合し、得られた融合細胞の中からHCV感受性細胞株IMY-N9細胞をクローニングした。IMY-N9はHepG2細胞とヒト肝細胞の染色体全てを持ち合わせており、ヒト肝細胞のphenotypeがHCV複製に関与していることが示された。IMY-N9と親細胞であるHepG2の宿主蛋白発現レベルをGeneChipを用いて比較すると、Heparan Sulfate Proteoglycan(HSPG)コア蛋白の1つであるGlypican-3、また肝特異的転写制御因子であるHepatocyte Nuclear Factor 4(HNF-4)のmRNA levelがIMY-N9で有意に上昇していた。HSPGはHCVと同じフラビウイルスに属するデングウイルスのレセプターとして近年報告されており、HIVやサイトメガロウイルスの細胞内エントリーにも関与している。IMY-N9のHCV感受性もGlypican-3高発現による可能性も示唆され、特にレセプター機能を持つ可能性がある。RT-PCRやWestern blot法の解析でもGlypican 3やHNF-4のIMY-N9における発現増強が確認された。更にHCVレセプターと報告されているCD81発現は認めず、IMY-N9への感染は異なるレセプターを介する事が示唆された。また、Huh7細胞での複製がLemonらによって確立されているHCV subgenomic replicon(NNeo3'-5')についてIMY-N9、HepG2での複製をRNA transfectionで検討するとIMY-N9のみにコロニー形成を認めた。しかし、複製効率はHuh7より低かった。一方、Wakitaらが確立したgenotype 2a由来のHCV subgenomic replicon(JFH-1)では両者にコロニー形成を認めたが、IMY-N9での複製がHuh7、HepG2より複製高率が高かった。更にJFH-1 subgenomic repliconが複製しているIMY-N9と患者血清を用いた感染実験を行うと、培養上清中に患者血清由来のHCVがオリジナルのIMY-N9より大量に放出されることが明らかとなった。