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表皮角化細胞のCa2+ATPase等Ca2+ホメオスタシスに関与する酵素異常解析

表皮角质形成细胞中参与Ca2+稳态的酶异常分析，例如Ca2+ATPase

基本信息

批准号：
15790564
负责人：
中村哲史
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Asahikawa Medical College
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15790564/
关键词：
Ca2-ATPase SERCA2b ダリエー病角化異常遺伝子治療 Ca2+ATPase

项目摘要

現在我々は、Ca2+ホメオスタシスに関与する酵素としてダリエー病の原因となっているCa2+ATPaseについて検討をすすめている。最近の報告で、SERCA2bはSERCA1と同様にDimerとして働いており、異常遺伝子産生SERCA2bが正常SERCA2bの発現を抑制したり、促進したりする可能性が示唆されている。このため、本病態の遺伝子治療の可能性は、それぞれの詳細な検討によってのみ、可能であると考えられる。最近我々は、I274V、L321F、M719Iの点遺伝子変異ダリエー病を発見し、これら遺伝子異常の生化学的なATPase活性、Ca2+取り込み量、リン酸化酵素の異性化の検討、さらに小胞体内Ca2+濃度増加による酵素の機能抑制などを注意深く行った。結果、これらの遺伝子異常SERCA2bは正常に小胞体に発現し、品質管理による分解システムを逃れた、正常な高次構造を持つことが示された。さらに、これらの異常SERCA2bではわずかなATPase活性の低下、リン酸化中間体の異性化の促進、リン酸化中間体の加水分解の速度低下、小胞体外側と内腔側のCa2+親和性の変化などを確認した(K Satoh et al. 2004 JBC)。これらのI274V、L321F、M719I異常SERCA2bはdimerとしての機能を保持していることが予想される。これらの異常によりおこる細胞死につき、正常SERCA2bをco-transfectionし、細胞死の抑制が起こるか、また、さらに、異常SERCA2bを導入した細胞に紫外線をあて、それによる細胞死と正常遺伝子導入による細胞死抑制を検討した。結果、異常遺伝子は、正常SERCA2bと同様にCOS-1細胞に発現した。発現した酵素を、活性を維持したまま、プレパレーションを行い、Western blottingでほぼ同量の発現を確認した。正常SERCA2bとI274V、L321F、M719Iの発現割合を検討するために、613X異常遺伝子をマーカーとして、正常:異常を1:0.5から1:1.5までの割合で導入発現を変更することが可能であることを確認した。COS-1細胞に異常遺伝子を導入した場合は、細胞死が正常の20-30%程度おこり、この細胞死は正常SERCA2bを1:1で導入しても、抑制されなかった。これらの細胞死はDNA Ladderで検討すると、アポトーシスを起こしていた。さらに長波紫外線を60mJ/cm2当てることにより、I274V、L321F、M719Iいづれもさらに細胞死を促進し、40-60%まで低下した。DNA laddarを起こしており、これらも、アポトーシスと考えられた。この紫外線による促進した細胞死はI274Vでは、正常SERCA2bを1:1で導入しても、抑制されなかったが、L321F、M719Iは30%程度(正常SERCA2b導入でも抑制されない程度)まで細胞死を抑制した。Laddarの形成も抑制され、アポトーシスを抑制したことが確認できた。これらの結果は、我々の発見した少なくともI274V、L321F、M719Iの異常遺伝子は少なくとも正常な高次機能を持っており、さらに、紫外線などの外的刺激により、ダリエー病での特徴的なアポトーシスが誘導され、また、L321F、M719I遺伝子異常では、正常遺伝子導入により、異常遺伝子の機能をある程度回復する可能性が示された。これらの結果は、異常遺伝子の変位部位によっては、遺伝子治療の可能性も示唆され、この治療は完全回復まではできないものの、増悪因子による皮疹の増悪には効果的であることが示唆された。

Now I'm talking about Ca2 +ATPase, the cause of the disease. Recent reports indicate that SERCA 2b is likely to inhibit or promote the occurrence of SERCA1 and SERCA 2b in the same way as Dimer and abnormal carriers. The possibility of treatment of this disease is discussed in detail. Recently, we have been paying close attention to the detection of different diseases in I274V, L321F and M719I, the abnormal biochemical ATPase activity, the concentration of Ca2 +, the study of the differentiation of acidifying enzymes, the increase of Ca2 + concentration in cells and the functional inhibition of enzymes. As a result, the genetic anomaly SERCA2b was found in normal small cells, the decomposition system for quality management was absent, and normal high-order structures were maintained. In addition, the abnormal SERCA2b was identified as a decrease in ATPase activity, a promotion of the heterogenization of the acidified intermediate, a decrease in the rate of hydrolysis of the acidified intermediate, and a change in Ca2 + affinity between the outer and inner sides of the vesicle (K Satoh et al. 2004 JBC). I274V, L321F, M719I abnormal SERCA2b function is maintained. The abnormal SERCA2b co-transfection, inhibition of cell death, and the abnormal SERCA 2b co-transfection, inhibition of cell death, and the abnormal SERCA2b co-transfection. The results showed that abnormal SERCA2b and COS-1 cells were detected simultaneously. The activity of the enzyme is maintained, and the activity of the enzyme is confirmed. Normal SERCA2b, I274V, L321F, M719I, 613X, abnormal, normal, abnormal, 1:0.5, 1:1.5, abnormal, abnormal. COS-1 cells were introduced with abnormal genes, and the cell death rate was 20-30% of normal. SERCA2b cells were introduced with abnormal genes 1:1, and the cell death rate was inhibited. The cell DNA Ladder is very important to us. When UVA 60mJ/cm2 is applied, the cell death rate of I274V, L321F and M719I is 40-60%. DNA laddar is ready to go, ready to go, ready to go. This UV radiation promotes cell death by I274V, normal SERCA2b 1:1, and inhibits cell death by L321F and M719I 30%(normal SERCA2b 1:1). Laddar's formation was confirmed. The results showed that the abnormal gene of I274V, L321F and M719I was less likely to be induced by ultraviolet light, and the abnormal gene of L321F and M719I was less likely to be induced by ultraviolet light, and the abnormal gene of I274V, L321F and M719I was less likely to be induced by ultraviolet light. The result is that the position of the abnormal gene is different, the possibility of gene treatment is different, the treatment is completely different, the increase factor is different, the result is different.