アミノアシルtRNA合成酵素を用いた非天然型アミノ酸の蛋白質への導入と実用化

使用氨酰-tRNA 合成酶将非天然氨基酸引入蛋白质并在其中实际应用

• 批准号: 04J11009
• 负责人: 小林 隆嗣
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J11009/
• 关键词: アミノアシルtRNA合成酵素; aaRS; タンパク質工学; ピロリジルtRNA合成酵素; PylRS; 非天然型アミノ酸; 遺伝暗号の拡張; チロシルtRNA合成酵素

アミノアシルtRNA合成酵素(aaRS)を改変して,非天然型アミノ酸を特異的に認識させようとする場合に,aaRSの基質結合部位の詳細な構造情報が,改変戦略の鍵となる.本研究では,メタン生成古細菌において新しく発見されたaaRSである,ピロリジルtRNA合成酵素(PylRS)を改変して,翻訳後修飾でつくられるリジン修飾体を,翻訳段階で部位特異的にタンパク質に導入する研究を行った.まず,動物細胞において,PylRSとアンバーサプレッサーtRNAであるtRNA^<Pyl>の組み合わせが,内在性aaRS・tRNAとは相互作用せず,アンバーコドン特異的な非天然型アミノ酸の導入に用いることができることを見出した.その際に,動物細胞における配列非依存的なtRNA発現法を開発した.PylRSは,tRNA^<Pyl>へ,元の基質であるピロリジンもしくは人工的なアミノ酸であるBoc-リジンを結合させる活性をもつ.大腸菌において,PylRS変異体を発現させたときに,あるリジン誘導体がtRNA^<Pyl>へと結合されたかどうかを検出する方法を確立した.野生型のPylRSでは,in vitro転写tRNA^<Pyl>に対しては十分に高い活性を有していたが,大腸菌内におけるサプレッション効率はとても低く,スクリーニングには不十分であった.そこで,ランダム変異をPylRSに導入し,サプレッション効率が向上した変異体をスクリーニングしたところ,リジン誘導体特異的PylRS変異体をスクリーニングするのに十分な基本的活性をもつ酵素が得られた.そのほかに,3-ヨードチロシンを認識する大腸菌TyrRS変異体と各基質との立体構造解析を進め,変異残基の役割を詳細に明らかにした.

The tRNA synthesis enzyme (aaRS) is modified, the non-natural enzyme (aaRS) is modified, and the complex of the aaRS gene is modified to make love. In this study, we found that the production of archaea, bacteria, bacteria, aaRS, tRNA synthase (PylRS), tRNA synthase (PylRS), biosynthesis enzyme (PylRS), antifungal bacteria, antifungal bacteria In vivo, PylRS, aaRS, tRNA, tRNA, aaRS, tRNA, aaRS, tRNA, and so on, there is a complex of tRNAs ^ & tRNAs, internal RNAs, RNAs, RNAs, This is a non-dependent method called tRNA. PylRS, tRNA^ & lt;Pyl>, which is not dependent on the number of cells. TRNA^ & TRNAs is used in this paper. The whole process is based on the combination of artificial antigenic acid and Boc- antioxidants. The results show that there is no significant difference in the number of bacteria in the PylRS system, and that the tRNAs ^ & lt;Pyl> in combination with the test results show that the method is correct. Wild type "PylRS", "in vitro" write tRNA ^ & lt;Pyl> virus virus "very high activity" has a high level of activity, the rate of infection in the fungus is very low, and the rate is not very high. In the first place, the PylRS was introduced, and the rate was higher than that of the normal body. The PylRS of the special body was very active, and the enzyme was very active. The whole body of TyrRS was analyzed by stereo analysis, and the residue was cut in service.

项目成果

Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid

通过光反应氨基酸的位点特异性掺入在哺乳动物细胞中进行蛋白质光交联

• 发表时间: 2005
• 期刊: Nature Methods 2
• 作者: Hino;N.
• 通讯作者: N.

Structural basis of nonnatural amino acid recognition by an engineered aminoacyl-tRNA synthetase for genetic code expansion

• DOI: 10.1073/pnas.0407039102
• 发表时间: 2005-02-01
• 期刊: PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA
• 影响因子: 11.1
• 作者: Kobayashi, T;Sakamoto, K;Yokoyama, S
• 通讯作者: Yokoyama, S