リアルタイムPCRを用いた水媒伝染性植物病原菌の定量的検出

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昨年度作成したPythium helicoidesおよびPhytophthora nicotianaeの種特異的プライマーとすでに当研究室でrDNA ITS領域から設計したプライマーについて、遺伝子のコピー数の種内変異を調べた。その結果、本研究で設計したプライマーはrDNA ITS領域由来のプライマーを用いた場合より変異の程度は低く、検出感度の菌株間差が少ないことから、定量に適していることが明らかになった。次に、このプライマーを用いた定量検出のため、サイバーグリーンによるリアルタイムPCRの条件設定を行った。サイバーグリーンを用いたリアルタイムPCRでは、非特異的な増幅が大きな問題となるため、非特異反応を抑制することが重要である。しかし、プライマーを通常の濃度でPCRしたところ、非特異的な増幅が認められた。そこで、感度が失われず、非特異的な増幅が見られない至適プライマー濃度とPCRの温度条件を明らかにした。また、環境サンプルからの菌の検出で最も重要であるDNAの抽出法について当研究室の方法と市販の抽出キットを比較し、至適抽出条件を明らかにした。これらの実験で明らかになったDNA抽出法およびPCR条件で、両菌の遊走子で汚染した水からDNAを抽出し、両菌に汚染された水耕溶液中の菌由来のDNA量を調べたところ、リアルタイムPCRにより菌量を推定することが可能となった。両菌の種特異的プライマーの設計、マルチプレックスPCRによる両菌の同時検出について、2006年9月にニュージーランドで開催された国際学会で発表し、Proceedingsとして3報にまとめた。