リアルタイムPCRを用いた水媒伝染性植物病原菌の定量的検出

使用实时 PCR 定量检测水生植物病原体

• 批准号: 04F04464
• 负责人: 景山 幸二
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Gifu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04F04464/
• 关键词: 水媒伝染性植物病原菌; 水耕栽培; 定量; Pythium属菌; PCR; 検出; Pythium族菌

昨年度作成したPythium helicoidesおよびPhytophthora nicotianaeの種特異的プライマーとすでに当研究室でrDNA ITS領域から設計したプライマーについて、遺伝子のコピー数の種内変異を調べた。その結果、本研究で設計したプライマーはrDNA ITS領域由来のプライマーを用いた場合より変異の程度は低く、検出感度の菌株間差が少ないことから、定量に適していることが明らかになった。次に、このプライマーを用いた定量検出のため、サイバーグリーンによるリアルタイムPCRの条件設定を行った。サイバーグリーンを用いたリアルタイムPCRでは、非特異的な増幅が大きな問題となるため、非特異反応を抑制することが重要である。しかし、プライマーを通常の濃度でPCRしたところ、非特異的な増幅が認められた。そこで、感度が失われず、非特異的な増幅が見られない至適プライマー濃度とPCRの温度条件を明らかにした。また、環境サンプルからの菌の検出で最も重要であるDNAの抽出法について当研究室の方法と市販の抽出キットを比較し、至適抽出条件を明らかにした。これらの実験で明らかになったDNA抽出法およびPCR条件で、両菌の遊走子で汚染した水からDNAを抽出し、両菌に汚染された水耕溶液中の菌由来のDNA量を調べたところ、リアルタイムPCRにより菌量を推定することが可能となった。両菌の種特異的プライマーの設計、マルチプレックスPCRによる両菌の同時検出について、2006年9月にニュージーランドで開催された国際学会で発表し、Proceedingsとして3報にまとめた。

The species-specific diversity of Pythium heliodes and Phytophthora nicotianas was studied in the laboratory last year. The results of this study are as follows: 1. The origin of rDNA in ITS field is low, the sensitivity of rDNA is low, and the quantification of rDNA is high. The next step is to set the PCR conditions for quantitative detection. The most important thing is that non-specific PCR amplification is a big problem, and non-specific PCR suppression is a big problem. The normal concentration of PCR and the non-specific amplitude of PCR are recognized. The sensitivity of PCR is different from that of other PCR products. The sensitivity is different from that of other PCR products. The most important thing is to compare the extraction method of DNA with the extraction method of market vendors, and to clarify the optimal extraction conditions. The DNA extraction method and PCR conditions of the bacteria are different. The DNA extraction method and PCR conditions of the bacteria are different. In September 2006, the International Society for the Development of Species-specific PCR and PCR for Detection of Bacteria was launched.

项目成果

Development of RAPD-derived SCAR markers for specific PCR detection of Phytophthora nicotianae.

开发 RAPD 衍生的 SCAR 标记，用于烟草疫霉的特异性 PCR 检测。

• 发表时间: 2006
• 期刊: Proceedings of the 4_<th> Australasian Soilborne Disease Symposium
• 作者: AHONSI;MO;Kageyama K
• 通讯作者: Kageyama K

Simultaneous detection of Phytophthora nicotianae and Pythium helicoides using multiplex species-specific SCAR primers.

使用多重物种特异性 SCAR 引物同时检测烟草疫霉和螺旋腐霉。

• 发表时间: 2006
• 期刊: Proceedings of the 4_<th> Australasian Soilborne Disease Symposium
• 作者: AHONSL;MO;Kageyama K
• 通讯作者: Kageyama K