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複合体結晶の構造決定に基づく構造特異的ヌクレアーゼFEN1の機能・制御機構の研究

基于复杂晶体结构测定的结构特异性核酸酶FEN1功能及调控机制研究

基本信息

批准号：
04J05010
负责人：
櫻井滋
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J05010/
关键词：
構造生物結晶構造 DNA複製 DNA修復

项目摘要

DNAの複製系において、岡崎フラグメントのRNAプライマーは最終的に副産物として鋳型鎖から引き剥がされ、FEN1によって構造特異的に切断除去される。また、FEN1の酵素活性は、DNAスライディングクランプであるPCNAと相互作用することによって、大幅に促進される。本研究では、既にヒト由来FEN1とPCNAとの複合体の結晶構造を決定したが、この構造には基質となるDNAが含まれていないため、FEN1によるDNAの認識機構や触媒機構を解明するまでには至らなかった。本研究では、これらの機構を解明することを目的として、本年度は、基質となるDNAを含めたFEN1-DNA複合体およびFEN1-PCNA-DNA複合体の結晶化条件の検索に努めた。一般的な経験則として、DNA-タンパク質複合体は、特定の塩基配列のDNAを用いて、PEGを沈殿剤としたときに結晶化に成功することが多い。本研究では、DNAとの複合体結晶を作製するために、新たに下記の3つの試料を準備して結晶化条件を検索した。第1に、触媒活性を失活する活性中心変異体や無駄な領域を省いた9種類のFEN1のコンストラクトを作製した。第2に、既に決定したFEN1-PCNA複合体の結晶構造を基にして、DNAを含めた立体構造モデルを作成した。そのモデルから、結晶化に適用できるDNAの長さを予測し、その予想に基づいて16種類の結晶化用のDNAを調整した。第3に、市販されている結晶化スクリーニングキットから、PEGを沈殿剤とする条件のみを抜粋して結晶化条件の検索に用いた。新たに調整した上記のFEN1とDNAの組み合わせを変えて結晶化条件を検索した結果、特定のDNAとFEN1のコンストラクトを組み合わせたFEN1-DNA複合体を用いたときのみ、幅広い条件で結晶が得られた。また、これらの結晶を用いて、放射光施設SPring-8で分解能5ÅのX線回折データの収集することに成功した。今後、FEN1-DNA複合体の最適な結晶化条件を検索して、高分解能のX線回折データを収集して、既に決定したヒトFEN1の立体構造をモデル分子とした分子置換法によって、複合体の結晶構造を決定する予定である。

The copy of DNA is the cutting off of the most important by-product, such as FEN1, FEN1, and so on, which is the most important by-product. Enzyme activity, FEN1 enzyme activity, DNA enzyme activity, PCNA interaction, enzyme activity, enzyme activity, enzyme activity, In this study, the origin of the FEN1 PCNA complex was determined by the analysis, the basic DNA was made by the computer, and the FEN1 was used by the DNA intelligence agency to understand the mechanism of the system. The purpose of this study is to clarify the conditions for the crystallization of FEN1-DNA complex and FEN1-PCNA-DNA complex in the current year, this year, and in the current year. This study is based on the understanding of the results of this study. In general, DNA- devices are integrated, DNA devices are configured on a specific basis, and PEG devices are crystallized successfully. In this study, the crystal of the complex of DNA and DNA was used to prepare the crystallization conditions of the new material. 1. Catalyst inactivation, inactivation, activity center, FEN1, inactivation, inactivation, activation, inactivation, inactivation, in In the second chapter, it is determined that the crystal of the FEN1-PCNA complex is based on the structure of the complex, and the structure of the DNA is stereoscopic. In order to improve the performance of the system, we use the DNA to improve the quality of the system, and we want to use the DNA to crystallize the basic system. In the third chapter, the crystallization condition of the market is different from that of the PEG, and the crystallization condition of the crystallization condition is different. In the new system, the FEN1 DNA was integrated, the crystallization conditions, the results, the specific DNA, the FEN1, the FEN1-DNA complex, and the format conditions were obtained. The results of optical and optical analysis show that the SPring-8 can be decomposed by X-ray and radiation. In the future, the most effective crystallization conditions of the FEN1-DNA complex, the X-ray analysis of the high decomposition energy, the determination of the three-dimensional structure of the FEN1, the molecular placement of the molecular structure, and the determination of the crystal structure of the complex, the determination of the molecular structure and the prediction of the molecular structure.