9-1-1複合体とPCNAによる標的タンパクとの相互作用と機能制御の構造学的研究

本研究では、Rad9-Rad1-Hus1複合体の結晶構造解析以外に、ダイナミン様タンパク(dynamin-like protein 1;DLP1)の結晶構造解析を通して、その機能と立体構造の相関関係の解明にも取り組んでいる。本研究の対象とするDLP1はダイナミン(Dynamin)ファミリーに分類される。ダイナミンはエンドサイトーシス時に出芽したクラスリン小胞のくびれを切り取って小胞を形成させるのに対して、DLP1はペルオキシソームやミトコンドリアの脂質2重層をくびり取ってそれらの分裂に関与している。両者は異なるオルガネラを標的としているが、そのドメイン構造や機能的な特徴から、オルガネラの脂質2重層をくびり取る構造学的な機構は似ていると考えられている。そこで、ダイナミンファミリーがオルガネラの脂質2重層をくびり取る機構と重合、脱重合の機構を構造学的に解析することを最終的な研究目標として、DLP1全長、GTPaseドメイン、GTPase effector domain(GED)の結晶構造解析を試みている。本研究では、CHO細胞由来DLP1を用いて多種類のコンストラクトを作製した。大腸菌を用いて、それらのコンストラクトの発現条件を検討した結果、DLP1全長、GTPaseドメインとGEDが大量発現し、可溶化画分で回収できることが判明した。GEDの精製を試みた結果、界面活性剤(DDM)存在下で安定に可溶化し、DDMが臨界ミセル濃度(CMC)以上で安定な単一組成なホモ多量体を形成することをゲル濾過分析によって確認した。現在、DLP1全長とGTPaseドメインの精製条件の検討と並行して、GEDの結晶化条件を検索している。今後、作製した各コンストラクトの精製条件を確立して、結晶化条件の検索、X線回折実験と立体構造解析を遂行して行く必要がある。

本研究では、Rad9-Rad1-Hus1複合体の結晶構造解析以外に、ダイナミン様タンパク(dynamin-like protein 1;DLP1)の結晶構造解析を通して、その機能と立体構造の相関関係の解明にも取り組んでいる。本研究の対象とするDLP1はダイナミン(Dynamin)ファミリーに分類される。ダイナミンはエンドサイトーシス時に出芽したクラスリン小胞のくびれを切り取って小胞を形成させるのに対して、DLP1はペルオキシソームやミトコンドリアの脂質2重層をくびり取ってそれらの分裂に関与している。両者は異なるオルガネラを標的としているが、そのドメイン構造や機能的な特徴から、オルガネラの脂質2重層をくびり取る構造学的な機構は似ていると考えられている。そこで、ダイナミンファミリーがオルガネラの脂質2重層をくびり取る機構と重合、脱重合の機構を構造学的に解析することを最終的な研究目標として、DLP1全長、GTPaseドメイン、GTPase effector domain(GED)の結晶構造解析を試みている。本研究では、CHO細胞由来DLP1を用いて多種類のコンストラクトを作製した。大腸菌を用いて、それらのコンストラクトの発現条件を検討した結果、DLP1全長、GTPaseドメインとGEDが大量発現し、可溶化画分で回収できることが判明した。GEDの精製を試みた結果、界面活性剤(DDM)存在下で安定に可溶化し、DDMが臨界ミセル濃度(CMC)以上で安定な単一組成なホモ多量体を形成することをゲル濾過分析によって確認した。現在、DLP1全長とGTPaseドメインの精製条件の検討と並行して、GEDの結晶化条件を検索している。今後、作製した各コンストラクトの精製条件を確立して、結晶化条件の検索、X線回折実験と立体構造解析を遂行して行く必要がある。