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9-1-1複合体とPCNAによる標的タンパクとの相互作用と機能制御の構造学的研究

9-1-1复合物与靶蛋白和PCNA相互作用和功能调节的结构研究

基本信息

批准号：
07J06607
负责人：
櫻井滋
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、Rad9-Rad1-Hus1複合体の結晶構造解析以外に、ダイナミン様タンパク(dynamin-like protein 1;DLP1)の結晶構造解析を通して、その機能と立体構造の相関関係の解明にも取り組んでいる。本研究の対象とするDLP1はダイナミン(Dynamin)ファミリーに分類される。ダイナミンはエンドサイトーシス時に出芽したクラスリン小胞のくびれを切り取って小胞を形成させるのに対して、DLP1はペルオキシソームやミトコンドリアの脂質2重層をくびり取ってそれらの分裂に関与している。両者は異なるオルガネラを標的としているが、そのドメイン構造や機能的な特徴から、オルガネラの脂質2重層をくびり取る構造学的な機構は似ていると考えられている。そこで、ダイナミンファミリーがオルガネラの脂質2重層をくびり取る機構と重合、脱重合の機構を構造学的に解析することを最終的な研究目標として、DLP1全長、GTPaseドメイン、GTPase effector domain(GED)の結晶構造解析を試みている。本研究では、CHO細胞由来DLP1を用いて多種類のコンストラクトを作製した。大腸菌を用いて、それらのコンストラクトの発現条件を検討した結果、DLP1全長、GTPaseドメインとGEDが大量発現し、可溶化画分で回収できることが判明した。GEDの精製を試みた結果、界面活性剤(DDM)存在下で安定に可溶化し、DDMが臨界ミセル濃度(CMC)以上で安定な単一組成なホモ多量体を形成することをゲル濾過分析によって確認した。現在、DLP1全長とGTPaseドメインの精製条件の検討と並行して、GEDの結晶化条件を検索している。今後、作製した各コンストラクトの精製条件を確立して、結晶化条件の検索、X線回折実験と立体構造解析を遂行して行く必要がある。

In this study, the crystal structure of Rad9-Rad1-Hus1 complex was analyzed, and the crystal structure analysis, function and three-dimensional structure correlation of Rad9-Rad1-Hus1 complex were clarified. This study aims to identify the first category of dynamin in the DLP. In the case of DLP1, the lipid 2 layer is divided into two layers: the first layer is divided into two layers: the second layer is divided into two layers: the first layer is divided into two layers: the second layer is divided into two layers: the third layer is divided into three layers: the third layer is divided into two layers: the third layer is divided into three layers: the fourth layer is divided into two layers: the fourth layer is divided into three layers: the fourth layer is divided into two layers: the fourth layer is divided into three layers: the fourth layer is divided into four layers: the fourth layer is divided into three layers; the fourth layer is divided into four layers; the fourth layer is divided into three layers; the fourth layer is divided into four layers. The structure and function of the structure are characterized by the structure and lipid layers. The structural mechanism is similar to that of the structure. The final purpose of this study is to analyze the crystal structure of DLP1, GTase effector domain (GED), and the total length of DLP1. In this study, CHO cells were used to control multiple kinds of cell types. The results of the examination of the conditions for the occurrence of Escherichia coli, the total length of DLP1, the occurrence of GTP1 and GED in large quantities, and the recovery of soluble components were identified. GED purification test results, stability solubilization in the presence of surfactant (DDM), DDM above critical concentration (CMC), stability of a single component, formation of multiple components, and filtration analysis were confirmed. At present, the whole length of DLP 1 and the refining conditions of GTPD are discussed in parallel, and the crystallization conditions of GED are discussed in detail. In the future, it is necessary to establish the refining conditions of each crystal, to search for crystallization conditions, to analyze X-ray inversion, and to analyze three-dimensional structure.