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構造生物学的手法によるユビキチン-プロテアソーム系の分子認識および作動機構の解析

利用结构生物学方法分析泛素-蛋白酶体系统的分子识别和运行机制

基本信息

批准号：
04J06128
负责人：
坂田絵理
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Nagoya City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J06128/
关键词：
ユビキチン結合酵素(E2)ユビキチンリガーゼ(E3)Nedd8 NMR X線結晶構造解析ユビキチンポリユビキチン鎖アタキシン神経変性疾患 Ufm1 ユビキチン様モディファイヤーマシャド・ジョセフ病パーキン α-シヌクレイン hHR23a 常染色体劣性若年性パーキンソン症候群

项目摘要

細胞周期の進行などに関わるユビキチンリガーゼ(E3)であるSCF複合体は、ユビキチン様タンパク質であるNedd8により修飾され、活性化されることが知られている。私は構造生物学的手法を用いてNedd8化修飾によるE3の活性化機構の解明を目指した。NMR解析により、Nedd8はIle44を中心とする疎水性表面を用いてUbc4と相互作用する一方で、Nedd8自身のE2であるUbc12とNedd8は相互作用しないことを明らかにした。Nedd8はUbc4のN末端セグメントに結合することを示した。興味深いことに、Ubc4分子表面上でNedd8結合部位とE3結合部位は隣接していることが判明した。さらに両者の相互作用部位をアラニンに1残基置換した各種変異体を作成し、変異が基質のユビキチン化に及ぼす影響を解析した。その結果、Nedd8変異体およびUbc4変異体がともにSCF複合体への活性化能が損なわれていることを明らかにした。以上の成果をもとに、ひとたびNedd8修飾を受けたSCF複合体はNedd8自身のE2であるUbc12を排除しつつ、Rbx1と協働してユビキチンのE2であるUbc4を選択的にリクルートすることにより、高いE3活性を獲得しているというモデルを提唱する。さらに、ユビキチンと共有結合を介して連結したUbc4 (Ubc4-Ub)の構造解析を行った。Ubc4の85番目のシステイン残基をセリンに置換した変異体を用いて、E1を用いた酵素反応によりユビキチンをエステル結合を介して連結させ、Ubc4-Ub複合体を調製した。蒸気拡散法によりUbc4-Ub複合体の結晶化に成功した。この結晶を用いて大型放射光施設を利用してX線回折実験を行い、その原子座標を2.2Åの分解能で決定した。本研究により、ユビキチン鎖形成反応の構造的基盤を与えることができた。

During the cell cycle, the cell cycle was divided into two parts: SCF complex (E3), Nedd8 complex (E3), Nedd8 complex (E3) and activation. The method of private engineering biology is to use the computer Nedd8 to modify the E3 activation mechanism to explain the target finger. NMR analysis, Nedd8 Ile44 center interaction, Ubc4 interaction, Nedd8 E2 interaction, Ubc12 interaction, Nedd8 interaction. Nedd8