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非天然補欠分子を導入した超高機能化ヘムタンパク質の創製

创建结合非天然假体分子的超高功能血红素蛋白

基本信息

批准号：
04J06764
负责人：
村田大
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

本報告者は活性中心にあるヘムを人工補欠分子に置換する補欠分子再構成法によって、ヘムタンパク質の機能改変・機能向上を目指している。ヘムタンパク質の一種である西洋ワサビペルオキシダーゼ(Horseradish peroxidase, HRP)は非常に高い酸化触媒活性を有する酸化酵素である。このHRPの機能向上を試み、合成によって得られたヘムの構造異性体である鉄ポルフィセンを有する再構成HRPの構築を実施した。実際に酸変性によってヘムを除去したアポHRPに鉄ポルフィセンを挿入し、カラムクロマトグラフィー(サイズ排除・陰イオン交換)による精製を経て鉄ポルフィセンを有する再構成HRPを得た。調製した再構成HRPと過酸化水素との反応を吸収スペクトルにより追跡したところ、2種類の中間体の生成が確認された。そのうち一つは鉄ポルフィセンのπカチオンラジカル種を示す820nm付近の吸収を有することから、oxoferryl πカチオンラジカル種であるcompound Iに相当する中間体であることが判明した。この鉄ポルフィセンのcompound Iの観測は初めての例であり、HRPタンパク質マトリックスを用いることで、穏やかな条件でその形成を確認することに成功した。またstopped-flow法により、過酸化水素存在下での2-methoxyphenolの酸化触媒反応における速度定数を評価した。その結果、compound Iにおける基質の酸化速度定数h、compound IIにおける基質の酸化速度定数k_3はともに天然HRPよりも大きく、再構成HRPにおける反応中間体の活性の高さが明らかとなった。さらにthioanisole酸化反応に対する再構成HRPの触媒活性も天然HRPの約20倍向上することが分かり、HRP内における鉄ポルフィセンの高酸化活性種の高い反応性が実証された。このように、鉄ポルフィセンを有する再構成HRPにおける反応中間体と、酸化触媒活性に対する新しい知見を得た。

This report aims to improve the function of active center by artificial molecular replacement and molecular reconstruction. Horseradish peroxidase (HRP) is a highly active acidifying enzyme. The function of this HRP has been tested upwards, and the structure of the HRP has been implemented after the structural variant of the obtained product has been synthesized. In the process of purification, HRP is removed from the system. The synthesis of HRP and H2O was investigated. The absorption of the compound near 820nm was identified as an intermediate. The test of the compound I of the iron compound was successful in confirming the formation of the compound I of the iron compound. The stopped-flow method was used to evaluate the reaction rate of 2-methoxyphenol in the presence of peracidified water. As a result, the acidification rate of compound I and compound II was determined by h and k_3 respectively. The catalytic activity of HRP is about 20 times higher than that of natural HRP, and the catalytic activity of HRP is about 20 times higher than that of HRP. The reaction intermediate and the acidification catalyst were found in the reaction mixture.