非天然補欠分子を導入した超高機能化ヘムタンパク質の創製

创建结合非天然假体分子的超高功能血红素蛋白

• 批准号: 04J06764
• 负责人: 村田 大
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J06764/
• 关键词: 鉄ポルフィセン; 再構成; 西洋ワサビペルオキシダーゼ; 酸化触媒活性; 反応中間体; 酸化触媒反応; ペルオキシダーゼ; 過酸化水素; ミオグロビン; 酸素錯体

本報告者は活性中心にあるヘムを人工補欠分子に置換する補欠分子再構成法によって、ヘムタンパク質の機能改変・機能向上を目指している。ヘムタンパク質の一種である西洋ワサビペルオキシダーゼ(Horseradish peroxidase, HRP)は非常に高い酸化触媒活性を有する酸化酵素である。このHRPの機能向上を試み、合成によって得られたヘムの構造異性体である鉄ポルフィセンを有する再構成HRPの構築を実施した。実際に酸変性によってヘムを除去したアポHRPに鉄ポルフィセンを挿入し、カラムクロマトグラフィー(サイズ排除・陰イオン交換)による精製を経て鉄ポルフィセンを有する再構成HRPを得た。調製した再構成HRPと過酸化水素との反応を吸収スペクトルにより追跡したところ、2種類の中間体の生成が確認された。そのうち一つは鉄ポルフィセンのπカチオンラジカル種を示す820nm付近の吸収を有することから、oxoferryl πカチオンラジカル種であるcompound Iに相当する中間体であることが判明した。この鉄ポルフィセンのcompound Iの観測は初めての例であり、HRPタンパク質マトリックスを用いることで、穏やかな条件でその形成を確認することに成功した。またstopped-flow法により、過酸化水素存在下での2-methoxyphenolの酸化触媒反応における速度定数を評価した。その結果、compound Iにおける基質の酸化速度定数h、compound IIにおける基質の酸化速度定数k_3はともに天然HRPよりも大きく、再構成HRPにおける反応中間体の活性の高さが明らかとなった。さらにthioanisole酸化反応に対する再構成HRPの触媒活性も天然HRPの約20倍向上することが分かり、HRP内における鉄ポルフィセンの高酸化活性種の高い反応性が実証された。このように、鉄ポルフィセンを有する再構成HRPにおける反応中間体と、酸化触媒活性に対する新しい知見を得た。

记者旨在通过用人工假体分子代替活性中心中的血红素来修饰和改善血红素蛋白的功能。辣根过氧化物酶（HRP）是一种血红素蛋白，是一种具有极高氧化催化活性的氧化酶。试图改善该HRP的功能，并构建具有卟啉铁的重构HRP，这是通过合成获得的血红素的结构异构体。将卟啉铁插入APOHRP中，实际上已通过酸修饰将其从血红素中取出，并通过柱色谱法（尺寸排除和阴离子交换）纯化，以获得用卟啉铁的重构HRP。通过吸收光谱跟踪制备的重构HRP和过氧化氢之间的反应，并确认了两种类型的中间体。其中一种具有约820 nm的吸收，代表卟啉铁的π阳离子自由基物种，发现它是与化合物I相对应的中间体。这是我们第一次观察到铁porphysen的化合物I，并且使用HRP蛋白基质，我们在轻度条件下成功证实了它的形成。此外，通过停止流量法评估了在存在过氧化氢的情况下2-甲氧基烯醇氧化催化反应的速率常数。结果，化合物I中底物的氧化速率常数H和化合物II中底物的氧化速率常数k_3均大于天然HRP的氧化速率k_3，揭示了反应中间体在重构HRP中的高活性。此外，发现重构HRP对硫烷氧化反应的催化活性的提高了约20倍，大约是天然HRP的20倍，这表明HRP内高度氧化活性活性物质的铁氯酮的高反应性。因此，关于与铁氯苯和氧化催化活性活性的重构HRP中反应中间体的新发现。

项目成果

Enhancement Peroxidase Activity in Myoglobin by Iron Porphycene as a Prosthetic Group

卟啉铁作为辅基增强肌红蛋白过氧化物酶活性

• 发表时间: 2004
• 期刊: Journal of Porphyrins and Phthalocyanines 8
• 作者: Mieko Morishima;Yasuo Kawaguchi;Kakigi Ryusuke;Dai Murata
• 通讯作者: Dai Murata