哺乳類中枢神経系におけるNotchシグナルの時間・空間的制御の解析

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本研究ではNotchシグナルの活性化を可視化する手法を開発し、生体内でのNotchシグナル活性化部位の同定、およびNotchシグナルによる神経幹細胞系譜の時間・空間的制御の解析に着手した。申請者はNotchシグナルの標的遺伝子hes1プロモーターおよびNotchシグナルの下流転写因子RBP-Jの結合配列制御下に改変型YFP(Yellow Fluorescent Protein)蛋白VenusのDNA配列を結合した遺伝子を持つレポーターシステムを作成した。さらにタンパク質の不安定性に関係するPEST配列をVenusに結合させ(dVenus)、半減期の短いレポーターも同時に作成し、Notchシグナルの活性化のon/offをより精妙に感知する手法を確立した。このレポーター遺伝子を胎生14日目のマウス胎児に電気穿孔法を用いて導入するとNotchの活性化は未分化神経幹細胞において選択的に生じていることが分かった。さらに、神経幹細胞の増殖能、自己複製能を評価するニューロスフェア法により、Notchシグナルの活性化が神経幹細胞の未分化維持能、多分化能に相関していることが明らかとなった。さらに、胎生後期より産生されるアストロサイトの分化とNotchシグナルの活性化との関係を調べたところ,Notchシグナルの活性化は成熟したアストロサイトには観察することができなかった。さらに、出生後直後のマウスに活性化Notchを電気穿孔法により大脳に導入するとアストロサイトの成熟が遅れることが分かった。しかしながら、Notchシグナルの活性化を阻害するγ-セクレターゼ阻害剤で処理すると神経幹細胞からアストロサイト分化は阻害されることから、Notchシグナルはアストロサイト分化に関しては神経幹細胞からアストロサイトへの初期誘導においては重要であるが,成熟にはむしろ阻害的であり,さらにNotchシグナルの活性化の度合いが低下することがアストロサイトの成熟に必要であることが示唆された。