神経活動依存的に分泌し、シナプス機能を制御するプロテアーゼの同定と作用機序の解析

研究代表者(以下代表者)は、シナプス間隙において蛋白質分解酵素(プロテアーゼ)活性がシナプス伝達を制御するのではないかとの仮説に取り組んだ。田口研究室ではこれまでに、電気生理学的手法により、ニワトリ胚終脳神経細胞培養系においてシナプス伝達を制御するプロテアーゼの存在を証明し、同培養上清から生化学的手法によりプロテアーゼ活性の高い分画を回収し、その分画について電気泳動後蛍光性のプロテアーゼ基質を用いたザイモグラフィーを行い、標的プロテアーゼ蛋白質の同定に成功している。そこで代表者は、まず標的プロテアーゼ候補が既知のものであるか解析した。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)とエレクトロスプレーイオントラップ質量分析計(ESI-IT/MS)による超微量蛋白質同定システムを用いて、上述のザイモグラフィー陽性バンド中に含まれる標的プロテアーゼの部分アミノ酸配列を決定した。その結果、標的プロテアーゼがヒトで既知な分泌型プロテアーゼ(以下ヒトプロテアーゼX)と高い相同性を示すことが明らかとなった。ニワトリにおいてプロテアーゼX(以下ニワトリプロテアーゼX)は単離されておらず、遺伝子の部分配列のみ報告されているに過ぎない。そこでニワトリの終脳からmRNAを回収し、ニワトリプロテアーゼXの遺伝子配列について解析した。その結果、5'領域の一部を除いてニワトリプロテアーゼXの遺伝子配列を決定した。また、以前代表者が取り組んでいた脳由来神経栄養因子によるシナプス伝達制御メカニズムへのプロテアーゼXの関与を検討した。まず、様々な培養ニューロンに脳由来神経栄養因子を投与し、プロテアーゼXの発現への影響を検討したが、顕著な作用は観られなかった。

研究代表者(以下代表者)は、シナプス間隙において蛋白質分解酵素(プロテアーゼ)活性がシナプス伝達を制御するのではないかとの仮説に取り組んだ。田口研究室ではこれまでに、電気生理学的手法により、ニワトリ胚終脳神経細胞培養系においてシナプス伝達を制御するプロテアーゼの存在を証明し、同培養上清から生化学的手法によりプロテアーゼ活性の高い分画を回収し、その分画について電気泳動後蛍光性のプロテアーゼ基質を用いたザイモグラフィーを行い、標的プロテアーゼ蛋白質の同定に成功している。そこで代表者は、まず標的プロテアーゼ候補が既知のものであるか解析した。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)とエレクトロスプレーイオントラップ質量分析計(ESI-IT/MS)による超微量蛋白質同定システムを用いて、上述のザイモグラフィー陽性バンド中に含まれる標的プロテアーゼの部分アミノ酸配列を決定した。その結果、標的プロテアーゼがヒトで既知な分泌型プロテアーゼ(以下ヒトプロテアーゼX)と高い相同性を示すことが明らかとなった。ニワトリにおいてプロテアーゼX(以下ニワトリプロテアーゼX)は単離されておらず、遺伝子の部分配列のみ報告されているに過ぎない。そこでニワトリの終脳からmRNAを回収し、ニワトリプロテアーゼXの遺伝子配列について解析した。その結果、5'領域の一部を除いてニワトリプロテアーゼXの遺伝子配列を決定した。また、以前代表者が取り組んでいた脳由来神経栄養因子によるシナプス伝達制御メカニズムへのプロテアーゼXの関与を検討した。まず、様々な培養ニューロンに脳由来神経栄養因子を投与し、プロテアーゼXの発現への影響を検討したが、顕著な作用は観られなかった。