リコンビナーゼ標的となる新規レポーター遺伝子の開発による感染過程特異遺伝子の同定

マメ科植物と根粒菌とが共生を成立させる機構は、未知の部分が残されている。本研究では、従来法では未同定の共生関連遺伝子を補足する為に、従来と原理的に異なった発現解析法を構築することを目標としている。具体的には、二次レポーターとしてリコンビナーゼ発現前と後に異なる薬剤耐性を付与する新しいマーカー遺伝子"Switching Gene"を設計・実体化し、これを用いてRecombinant in vivo expression technoiogy(RIVET)法を改皐、新しい系として、Flip RIVET(FRIVET)法を構築する。昨年度までに、一次レポーターベクターとして、上流にT7の転写終結因子をもち、プロモーターを持たないR-recombinaseを導入した広域宿主ベクターと、カナマイシン耐性遺伝子内部に、味噌・醤油酵母由来R-recombinaseの認識配列に挟まれたスペクチノマイシン耐性遺伝子を埋め込んだSwitching Geneを構築した。今年度は、Switching Geneをミヤコグサ根粒菌MAFF303099株のゲノム内部に組み込み、一次レポーターの受容株として、EMD402株を構築した。この株は、組み換え前はスペクチノマイシン耐性、組み換え後はカナマイシン耐性を示した。また、系の有効性を確認する為に、共生時根粒内で発現する遺伝子、nifHのプロモーター領域と、共生成立過程において発現する遺伝子、nodAのプロモーター領域をR-recombinase上流に繋いだプラスミドをEMD402株に導入した。それぞれをミヤコグサに感染させた後、形成した根粒から菌体を回収すると、どちらも99%以上がスペクチノマイシン感受性、カナマイシン耐性であった。この結果は、構築したFRIVET法が、共生により誘導される遺伝子のスクリーニングにも利用可能なことを支持している。

マメ科植物と根粒菌とが共生を成立させる機構は、未知の部分が残されている。本研究では、従来法では未同定の共生関連遺伝子を補足する為に、従来と原理的に異なった発現解析法を構築することを目標としている。具体的には、二次レポーターとしてリコンビナーゼ発現前と後に異なる薬剤耐性を付与する新しいマーカー遺伝子"Switching Gene"を設計・実体化し、これを用いてRecombinant in vivo expression technoiogy(RIVET)法を改皐、新しい系として、Flip RIVET(FRIVET)法を構築する。昨年度までに、一次レポーターベクターとして、上流にT7の転写終結因子をもち、プロモーターを持たないR-recombinaseを導入した広域宿主ベクターと、カナマイシン耐性遺伝子内部に、味噌・醤油酵母由来R-recombinaseの認識配列に挟まれたスペクチノマイシン耐性遺伝子を埋め込んだSwitching Geneを構築した。今年度は、Switching Geneをミヤコグサ根粒菌MAFF303099株のゲノム内部に組み込み、一次レポーターの受容株として、EMD402株を構築した。この株は、組み換え前はスペクチノマイシン耐性、組み換え後はカナマイシン耐性を示した。また、系の有効性を確認する為に、共生時根粒内で発現する遺伝子、nifHのプロモーター領域と、共生成立過程において発現する遺伝子、nodAのプロモーター領域をR-recombinase上流に繋いだプラスミドをEMD402株に導入した。それぞれをミヤコグサに感染させた後、形成した根粒から菌体を回収すると、どちらも99%以上がスペクチノマイシン感受性、カナマイシン耐性であった。この結果は、構築したFRIVET法が、共生により誘導される遺伝子のスクリーニングにも利用可能なことを支持している。