昆虫サイトカインGBPの作用機構の解明:GBP受容体の単離と高次構造解析

アワヨトウから単離された昆虫サイトカインGrowth-blocking peptide(GBP)の作用機構の解明を目的として、GBPの作用よりリン酸化される血球タンパク質の解析を行った。その結果、GBP作用後急速にチロシンリン酸化が生じる分子量77kDaの膜タンパク質(P77)を発見した。初年度、P77を精製しcDNAを単離した結果、p77はシグナルペプチド配列、細胞外領域、膜貫通領域、細胞内領域からなる一回膜貫通型の新規の分子と推測された。本年度は以下の項目を実施し結果を得た。1、P77発現部位RT-PCR法を用いて、血球、脳での発現を確認した。抗P77抗体を用いた免疫組織化学的解析により、血球ではプラズマ細胞のみで、脳では後部中央の2対の神経細胞での特異的発現を確認した。また、プラズマ細胞では細胞膜上と核周辺で局在していた。2、P77相同遺伝子ヨトウガ血球、ハスモンヨトウ血球、培養細胞Sf9より、相同性遺伝子を単離した。得られた分子は、アワヨトウP77と同様に、一回膜貫通型の膜タンパク質であり、細胞内領域に特に相同性の高い4つの領域を有していた。3、RNAiアワヨトウ血球のp77の発現を特異的に抑制し、その表現系を解析するために2本鎖P77RNA(dsRNA)を作成した。In vitroでdaRNAの効果を解析した結果、p77のmRNAの減少が確認された。4、P77糖鎖解析P77の1次構造から予想される分子量は約60kDaであるが、実際SDS-PAGEによる解析では77kDaである。P77を免疫沈降法を用いて精製し、これにO-グリコシダーゼまたはN-グリコシダーゼを作用させたところN-グリコシダーゼでのみ分子量が減少した事から、細胞外領域にN-グリコシド結合で糖鎖が付加されていることを確認した。

アワヨトウから単離された昆虫サイトカインGrowth-blocking peptide(GBP)の作用機構の解明を目的として、GBPの作用よりリン酸化される血球タンパク質の解析を行った。その結果、GBP作用後急速にチロシンリン酸化が生じる分子量77kDaの膜タンパク質(P77)を発見した。初年度、P77を精製しcDNAを単離した結果、p77はシグナルペプチド配列、細胞外領域、膜貫通領域、細胞内領域からなる一回膜貫通型の新規の分子と推測された。本年度は以下の項目を実施し結果を得た。1、P77発現部位RT-PCR法を用いて、血球、脳での発現を確認した。抗P77抗体を用いた免疫組織化学的解析により、血球ではプラズマ細胞のみで、脳では後部中央の2対の神経細胞での特異的発現を確認した。また、プラズマ細胞では細胞膜上と核周辺で局在していた。2、P77相同遺伝子ヨトウガ血球、ハスモンヨトウ血球、培養細胞Sf9より、相同性遺伝子を単離した。得られた分子は、アワヨトウP77と同様に、一回膜貫通型の膜タンパク質であり、細胞内領域に特に相同性の高い4つの領域を有していた。3、RNAiアワヨトウ血球のp77の発現を特異的に抑制し、その表現系を解析するために2本鎖P77RNA(dsRNA)を作成した。In vitroでdaRNAの効果を解析した結果、p77のmRNAの減少が確認された。4、P77糖鎖解析P77の1次構造から予想される分子量は約60kDaであるが、実際SDS-PAGEによる解析では77kDaである。P77を免疫沈降法を用いて精製し、これにO-グリコシダーゼまたはN-グリコシダーゼを作用させたところN-グリコシダーゼでのみ分子量が減少した事から、細胞外領域にN-グリコシド結合で糖鎖が付加されていることを確認した。