遺伝子改変ブタを用いたヒト造血幹細胞評価システムの構築

我々の研究室では既に経子宮的にブタ胎児腹腔内に臍帯血由来のヒト造血幹細胞を移植し、出生後ヒト血球細胞をもった血液キメラブタの作製に成功していた。しかしこれらのブタ血液中にしめるヒト細胞の頻度は非常に低いため、ブタ体内におけるヒト血球細胞のgrowth advantageを得るため、遺伝子破壊によって高度の貧血をきたすようなレシピエントブタを作製することにした。標的とする遺伝子としては、c-kit遺伝子とPU.1遺伝子を試みた。農業科学技術研究所より梅山ブタ、ランドレースブタ由来の細胞を採取してもらい各ブタ数個体由来のゲノムライブラリーを作製した。このライブラリーをスクリーニングし、PU.1、c-kit各遺伝子座の15〜20Kbのゲノム断片を得た。ブタなどの家畜動物は個体間での遺伝的多系が存在し、そのため相同組み換えに用いる細胞と同じ個体(isogenic)由来のコンストラクトを用いる必要がある。そめため、それぞれの遺伝子に対し、数個体由来のコンストラクトを構築した。構築したベクターをそれぞれのブタ由来の初代培養繊維芽細胞に導入し、薬剤選択を行った後、PCRによって標的遺伝子座の相同組み換えの有無をスクリーニングした。しかし、ブタ繊維芽細胞はこれらのlocusにおいて非常に相同組み替え効率が低く、合計約2000クローンのスクリーニングのうち組換えの検出は9クローンのみしか得られなかった。また、クローニングした組換え細胞は、核移植によってブタ個体を作製するにあたって、非常に増殖状態が悪く、今のところ利用しうる株は得られていない。相同組み換えの効率を上げるため、ベクター側において、polyA less, promotor lessなどのテクニックを導入しているところである。

我々の研究室では既に経子宮的にブタ胎児腹腔内に臍帯血由来のヒト造血幹細胞を移植し、出生後ヒト血球細胞をもった血液キメラブタの作製に成功していた。しかしこれらのブタ血液中にしめるヒト細胞の頻度は非常に低いため、ブタ体内におけるヒト血球細胞のgrowth advantageを得るため、遺伝子破壊によって高度の貧血をきたすようなレシピエントブタを作製することにした。標的とする遺伝子としては、c-kit遺伝子とPU.1遺伝子を試みた。農業科学技術研究所より梅山ブタ、ランドレースブタ由来の細胞を採取してもらい各ブタ数個体由来のゲノムライブラリーを作製した。このライブラリーをスクリーニングし、PU.1、c-kit各遺伝子座の15〜20Kbのゲノム断片を得た。ブタなどの家畜動物は個体間での遺伝的多系が存在し、そのため相同組み換えに用いる細胞と同じ個体(isogenic)由来のコンストラクトを用いる必要がある。そめため、それぞれの遺伝子に対し、数個体由来のコンストラクトを構築した。構築したベクターをそれぞれのブタ由来の初代培養繊維芽細胞に導入し、薬剤選択を行った後、PCRによって標的遺伝子座の相同組み換えの有無をスクリーニングした。しかし、ブタ繊維芽細胞はこれらのlocusにおいて非常に相同組み替え効率が低く、合計約2000クローンのスクリーニングのうち組換えの検出は9クローンのみしか得られなかった。また、クローニングした組換え細胞は、核移植によってブタ個体を作製するにあたって、非常に増殖状態が悪く、今のところ利用しうる株は得られていない。相同組み換えの効率を上げるため、ベクター側において、polyA less, promotor lessなどのテクニックを導入しているところである。