ヒトREV3タンパク質の大腸菌における発現誘導系の構築と精製法の確立

人REV3蛋白大肠杆菌表达诱导体系的构建及纯化方法

• 批准号: 04J52862
• 负责人: 朴 金蓮
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J52862/
• 关键词: REV3遺伝子; 損傷乗り越えDNA合成; PCRによる塩基置換導入法; 組み換えREV3タンパク質; 突然変異; 遺伝子発現誘導; アフィニティークロマトグィ; 大腸菌のシャペロン遺伝子; 損傷乗り換えDNA合成; PCRによる塩基置換導入; 使用頻度の低いコドン; 使用頻度の高いコドン; Hisアフイニテイークロマトグラフイ; FLAGアフイニテイークロマトグラフイ

ヒトREV3タンパク質はヒトでの損傷乗り越え(translesion)DNA合成経路の生化学的解析に必要不可欠なタンパク質因子の一つである。本研究では、組み換えREV3タンパク質を大腸菌で効率よく発現誘導させる系を構築し、組み換えREV3タンパク質の精製法を確立することを目的とする。これまでは、REV3遺伝子が350kDaという巨大タンパク質をコードすることから、組み換えタンパク質の発現誘導が難しく研究の防げとなっていた。実際に、ヒトREV3遺伝子を大腸菌で発現させたところ、REV3タンパク質に相当する産物を確認することができなかった。ヒトREV3遺伝子のコドン組成は大腸菌での使用頻度の低いコドンが多く、REV3タンパク質をコードするコドン3133個のうち、大腸菌での使用頻度の低いコドンは763個見出され、これが発現の阻害要因であると考えられた。そこで、PCRによる塩基置換導入法を使って、REV3遺伝子の大腸菌での使用頻度の低いコドン763個のうち、299個のコドンを大腸菌での使用頻度の高いコドンに置換した。改変REV3遺伝子を大腸菌において発現させた結果、コドン改変前には全く発現が観察することができなかった組み換えREV3タンパグ質が、コドン改変後には銀染色で観察することができるレベルまで増加することが分かった。このタンパク質の見かけ上の分子サイズは350KDaにほぼ一致し、またREV3タンパク質の特異的な抗体を用いたウェスタンブロットを行った結果、組み換えREV3タンパク質の発現が誘導されたことが明らかになった。また、精製をより容易にするために、N-末端にHisタグ、C-末端にFLAGタグを付けた。発現誘導処理した菌体を溶菌し、可溶性画分として回収された大腸菌粗抽出液をFLAG抗体カラムにかけ、FLAGペプチドにより溶出した後、キレーティングセファロース(chelating sepharose)にニッケル(Ni)を結合させたカラムにかけ、イミダゾール(imidazole)の濃度を上げてカラムから溶出した。これにより、組み換えREV3タンパク質の部分精製に成功した。また、大腸菌のシャペロン(trigger factor)遺伝子を導入共発現し精製を試みた。今後は、菌体破砕法の条件を検討し、精製度の高い可溶性組み換えREV3タンパク質を得ることを目指す。

ヒ ト REV3 タ ン パ ク qualitative は ヒ ト で の damage 乗 り more え (translesion DNA synthesis 経 road の biochemical analytical に need not owe な タ ン パ ク qualitative factor の つ で あ る. This study で は, group み in え REV3 タ ン パ ク qualitative を coliform で sharper rate よ く 発 now induced さ せ み る を build し, group in え REV3 タ ン パ ク qualitative を の refining method established す る こ と を purpose と す る. こ れ ま で は, REV3 but 伝 が 350 kda と い う huge タ ン パ ク qualitative を コ ー ド す る こ と か ら, group み in え タ ン パ ク qualitative の 発 now induced が difficult し く research の げ prevention と な っ て い た. Son be interstate に, ヒ ト REV3 heritage 伝 を coliform で 発 now さ せ た と こ ろ, REV3 タ ン パ ク qualitative に quite す る product を confirm す る こ と が で き な か っ た. ヒ ト REV3 posthumous son 伝 の コ ド ン composition は coliform で の using low frequency の い コ ド ン が く, REV3 タ ン パ ク qualitative を コ ー ド す る コ ド ン 3133 の う ち, coliform で の using low frequency の い コ ド ン は 763 show the さ れ, こ れ が 発 is の resistance to harm by で あ る と exam え ら れ た. そ こ で, PCR に よ る salt base substitution import method を make っ て, REV3 but 伝 の coliform で の using low frequency の い コ ド ン 763 の う ち, 299 の コ ド ン を coliform で の using high frequency の い コ ド ン に replacement し た. Traces of change - REV3 伝 son を coliform に お い て 発 now さ せ た results, コ ド ン change - former に は full く 発 now が 観 examine す る こ と が で き な か っ み た group in え REV3 タ ン パ グ が, コ ド ン after changing - に は silver staining で す was 観 る こ と が で き る レ ベ ル ま で raised plus す る こ と が points か っ た. こ の タ ン パ ク qualitative の see か け の molecules on サ イ ズ は 350 kda に ほ ぼ consistent し, ま た REV3 タ ン パ ク qualitative の specific antibody を な with い た ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト を line っ た result, group み change え REV3 タ ン パ ク qualitative の 発 now が induced さ れ た こ と が Ming ら か に な っ た. Youdaoplaceholder0, refined をよ けた is easy to にするために, n-terminal にHisタグ, c-terminal にFLAGタグを is combined with けた. を 発 now induced 処 Richard し た bacteria lysis し, soluble draw points と し て back 収 さ れ た coliform crude extract を FLAG antibody カ ラ ム に か け, FLAG ペ プ チ ド に よ り dissolution し た, キ レ ー テ ィ ン グ セ フ ァ ロ ー ス (chelating Sepharose) に ニ ッ ケ ル (Ni) を さ せ た カ ラ ム に か け, イ ミ ダ ゾ ー ル (imidazole) の concentration を げ て カ ラ ム か ら dissolution し た. Youdaoplaceholder5 れによ れによ れによ, group み replaced with えREV3タ タ パ パ partial refining of the green particle に successful た た. Youdaoplaceholder0, the residual 伝 of escherichia coli シャペロ <e:1> (trigger factor) を were introduced to co-produce refined を test みた. Future は conditions, bacteria break 砕 の を beg し 検 soluble group, high pure system の い み in え REV3 タ ン パ ク qualitative を must る こ と を refers す.