ヒトDNAポリメラーゼκの損傷乗り越えDNA合成に関する構造生物学的研究

ヒトDNAポリメラーゼκ(pol κ)は870アミノ酸からなる分子量100kpaのDNA合成酵素である。pol κは、タバコの煙や排煙中に含まれるベンゾピレンによって損傷したDNAを鋳型にして、正しくDNAを複製できるため、損傷乗り越え型DNA合成酵素として注目されている。pol κ全長は、触媒活性を有するN末65kDaとC末35kDaに分解されやすい。そこで、まずはN末65kDa(pol κ ΔC)をターゲットとし、発現・精製・結晶化を行った。C末に6残基のヒスチジンを付加させたpol κ ΔCを大腸菌内に大量発現させ、菌体を超音波破砕し、ニッケルアフィニティー樹脂Ni-NTA、および陽イオン交換カラムHiTrapSP、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製を行い、純粋なpol κ ΔCを得ることに成功した。pol κ ΔCを濃縮し、pol κ ΔC単独及び、DNA複合体での結晶化条件の検索を行った。3,000条件を超える条件検討を行った結果、MPDを沈殿剤とした場合に板状の微結晶が得られたが、X線回折実験に適した結晶を得ることができなかった。結晶構造解析に適したpol κ ΔCの結晶が得られない理由として、本来あるべきC末領域がないため、揺らぎの大きな構造となり、結晶化しにくいのではないかと考えた。そこで、全長pol κをターゲットとし、全長pol κの大量発現、精製を試みた。全長pol κを大腸菌内で発現させた場合、pol κの発現量は極めて少なく、純粋なpol κを精製することがこれまで困難であった。しかし今回、培養条件およびIPTG誘導の条件を詳細に検討したところ、全長pol κの発現量を増加させることに成功した。さらにpol κ ΔCと同様な精製プロトコルで純粋な全長pol κを得ることができた。現在は、全長pol κ及びそのDNA複合体での結晶化を行うとともに、pol κ ΔC-DNA複合体の結晶化条件の最適化を行っているが、これまでにX線回折実験に適した結晶は得られていない。

ヒトDNAポリメラーゼκ(pol κ)は870アミノ酸からなる分子量100kpaのDNA合成酵素である。pol κは、タバコの煙や排煙中に含まれるベンゾピレンによって損傷したDNAを鋳型にして、正しくDNAを複製できるため、損傷乗り越え型DNA合成酵素として注目されている。pol κ全長は、触媒活性を有するN末65kDaとC末35kDaに分解されやすい。そこで、まずはN末65kDa(pol κ ΔC)をターゲットとし、発現・精製・結晶化を行った。C末に6残基のヒスチジンを付加させたpol κ ΔCを大腸菌内に大量発現させ、菌体を超音波破砕し、ニッケルアフィニティー樹脂Ni-NTA、および陽イオン交換カラムHiTrapSP、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製を行い、純粋なpol κ ΔCを得ることに成功した。pol κ ΔCを濃縮し、pol κ ΔC単独及び、DNA複合体での結晶化条件の検索を行った。3,000条件を超える条件検討を行った結果、MPDを沈殿剤とした場合に板状の微結晶が得られたが、X線回折実験に適した結晶を得ることができなかった。結晶構造解析に適したpol κ ΔCの結晶が得られない理由として、本来あるべきC末領域がないため、揺らぎの大きな構造となり、結晶化しにくいのではないかと考えた。そこで、全長pol κをターゲットとし、全長pol κの大量発現、精製を試みた。全長pol κを大腸菌内で発現させた場合、pol κの発現量は極めて少なく、純粋なpol κを精製することがこれまで困難であった。しかし今回、培養条件およびIPTG誘導の条件を詳細に検討したところ、全長pol κの発現量を増加させることに成功した。さらにpol κ ΔCと同様な精製プロトコルで純粋な全長pol κを得ることができた。現在は、全長pol κ及びそのDNA複合体での結晶化を行うとともに、pol κ ΔC-DNA複合体の結晶化条件の最適化を行っているが、これまでにX線回折実験に適した結晶は得られていない。