骨格筋不死化細胞に由来する筋知覚神経軸索伸長因子の解析とクローニング

本研究の目的は、障害を受けた末梢神経,特に筋収縮情報を中枢へ伝達する筋知覚神経の再生をめざして,ラット筋芽細胞由来の知覚神経軸索伸長因子を生化学的に同定し、クローニングすることである。そこで平成16年度は平成15年度の成果を踏まえ以下の研究を行った.ラット筋芽細胞株L6より,すでに平成15年度に確立した方法で伸長活性を有するL6培養上清(L6CM)を調製し,生化学的方法により濃縮を行い,MS/MS解析を行った.その結果Pigent epithelium-derived factor(PEDF)という黒色色素細胞に由来する成長因子が複数のバンドで検出された.そこで,本年度はPEDFをラットL6細胞よりRT-PCRによりクローニングし,大腸菌発現ベクターpGEX6Pベクターにサブクローニングし,大腸菌においてepitope-tagging融合蛋白質として発現させ調製した.しかし,これらの蛋白質にはニワトリ胚由来後根神経節細胞器官培養系における軸索伸長評価系においてL6CMに認められるような顕著な活性は認められなかったが,シュワン細胞の遊走性を活性化することが明らかになった.したがって,PEDFはL6CMにおける筋知覚神経の神経軸索伸長活性の本体ではないと予想された.そこで,さらに他のバンドに由来する分子を検討したところ,Insulin like Growth Factor I Binding Protein 6(IGFBP6)が見出された.IGFそのものはMS/MS解析では範囲外のバンドであったが,IGF-Iが本体である可能性が示唆されたので,IGFの効果を検証したところ,L6CMと同等の活性があることが明らかになった.IGF-Iの筋知覚神経軸索の伸長活性の分子機序については未だ不明の部分が多いが,今後,IGF-I/IGFBP6複合体の筋知覚神経の軸索伸長における作用機序,またin vivo除神経モデル動物における神経軸索再生時の作用機序についてさらなる研究が必要である.

本研究の目的は、障害を受けた末梢神経,特に筋収縮情報を中枢へ伝達する筋知覚神経の再生をめざして,ラット筋芽細胞由来の知覚神経軸索伸長因子を生化学的に同定し、クローニングすることである。そこで平成16年度は平成15年度の成果を踏まえ以下の研究を行った.ラット筋芽細胞株L6より,すでに平成15年度に確立した方法で伸長活性を有するL6培養上清(L6CM)を調製し,生化学的方法により濃縮を行い,MS/MS解析を行った.その結果Pigent epithelium-derived factor(PEDF)という黒色色素細胞に由来する成長因子が複数のバンドで検出された.そこで,本年度はPEDFをラットL6細胞よりRT-PCRによりクローニングし,大腸菌発現ベクターpGEX6Pベクターにサブクローニングし,大腸菌においてepitope-tagging融合蛋白質として発現させ調製した.しかし,これらの蛋白質にはニワトリ胚由来後根神経節細胞器官培養系における軸索伸長評価系においてL6CMに認められるような顕著な活性は認められなかったが,シュワン細胞の遊走性を活性化することが明らかになった.したがって,PEDFはL6CMにおける筋知覚神経の神経軸索伸長活性の本体ではないと予想された.そこで,さらに他のバンドに由来する分子を検討したところ,Insulin like Growth Factor I Binding Protein 6(IGFBP6)が見出された.IGFそのものはMS/MS解析では範囲外のバンドであったが,IGF-Iが本体である可能性が示唆されたので,IGFの効果を検証したところ,L6CMと同等の活性があることが明らかになった.IGF-Iの筋知覚神経軸索の伸長活性の分子機序については未だ不明の部分が多いが,今後,IGF-I/IGFBP6複合体の筋知覚神経の軸索伸長における作用機序,またin vivo除神経モデル動物における神経軸索再生時の作用機序についてさらなる研究が必要である.