新規遺伝性腎がんラットのTransgenic rescueと遺伝子機能の解明

新規遺伝性腎がんラットであるNihonラットの腎がん発生の原因が、ヒトのBirt-Hogg-Dube症候群の原因遺伝子であるBHD遺伝子のラットホモログに生じたgerm line mutationであることが明らかになった。本年度は、まず昨年度樹立した野生型Bhd遺伝子導入トランスジェニックNihonラットの表現型の解析を中心に行い、腎発癌の抑制と胎生致死の回避を複数の独立したラインで確認することができた。これらの結果からBhd遺伝子がNihonラットの腎発癌ならびに胎生致死の原因遺伝子であることを最終的に証明できたものと考える。またBhd産物の機能を明らかにする手がかりとして、以下の結果を得た。細胞内でのBhdの局在を、タグを付加した強制発現系を用いて検討した結果、核および細胞質の両方にびまん性に存在することが確認された。臓器における発現など内在性の発現様式に関しては、現在Bhdに対する特異抗体を用いて検討中である。またBhd結合タンパクに関して、Bhdに対する抗体を用いた免疫共沈降法とSDS-PAGEによる検討を行った結果、150kD付近の特異的なバンドを候補として認めた。現在このバンドを切り出し、アミノ酸配列のシークエンスを試みている。Bhdのリン酸化部位に関しては、ウェスタンブロットにより検出されるBhd産物の複数のバンドが、ホスファターゼ処理により、より移動度の速いバンドに収束することを確認した。次に、BhdをN末とC末に二分して発現させたところ、N末にリン酸化部位が存在することが予想された。現在リン酸化部位の候補となるセリン/スレオニンをアラニンに換えたアミノ酸置換Bhd変異体発現プラスミドを作製しており、それらを利用して最終的にリン酸化部位を同定する予定である。また、本研究においてはNihonラット腎癌由来の培養細胞に、Bhd遺伝子発現系を再導入した細胞株の樹立も進めた。現在樹立の最終段階であり、今後これらの細胞株をBhd産物の機能解析のツールとして利用する予定である。

新規遺伝性腎がんラットであるNihonラットの腎がん発生の原因が、ヒトのBirt-Hogg-Dube症候群の原因遺伝子であるBHD遺伝子のラットホモログに生じたgerm line mutationであることが明らかになった。本年度は、まず昨年度樹立した野生型Bhd遺伝子導入トランスジェニックNihonラットの表現型の解析を中心に行い、腎発癌の抑制と胎生致死の回避を複数の独立したラインで確認することができた。これらの結果からBhd遺伝子がNihonラットの腎発癌ならびに胎生致死の原因遺伝子であることを最終的に証明できたものと考える。またBhd産物の機能を明らかにする手がかりとして、以下の結果を得た。細胞内でのBhdの局在を、タグを付加した強制発現系を用いて検討した結果、核および細胞質の両方にびまん性に存在することが確認された。臓器における発現など内在性の発現様式に関しては、現在Bhdに対する特異抗体を用いて検討中である。またBhd結合タンパクに関して、Bhdに対する抗体を用いた免疫共沈降法とSDS-PAGEによる検討を行った結果、150kD付近の特異的なバンドを候補として認めた。現在このバンドを切り出し、アミノ酸配列のシークエンスを試みている。Bhdのリン酸化部位に関しては、ウェスタンブロットにより検出されるBhd産物の複数のバンドが、ホスファターゼ処理により、より移動度の速いバンドに収束することを確認した。次に、BhdをN末とC末に二分して発現させたところ、N末にリン酸化部位が存在することが予想された。現在リン酸化部位の候補となるセリン/スレオニンをアラニンに換えたアミノ酸置換Bhd変異体発現プラスミドを作製しており、それらを利用して最終的にリン酸化部位を同定する予定である。また、本研究においてはNihonラット腎癌由来の培養細胞に、Bhd遺伝子発現系を再導入した細胞株の樹立も進めた。現在樹立の最終段階であり、今後これらの細胞株をBhd産物の機能解析のツールとして利用する予定である。