光機能性生体分子によるアポトーシスの誘導と癌治療への応用

光功能生物分子诱导细胞凋亡及其在癌症治疗中的应用

• 批准号: 15710161
• 负责人: 遠藤 政幸
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15710161/
• 关键词: アポトーシス; カスパーゼ-3; 光化学; 非天然アミノ酸; 細胞外翻訳反応; 細胞導入; 癌治療

アポトーシス(プログラムされた細胞死)の誘導による癌細胞の除去を目的とし、最終段階で働くプロテアーゼであるcaspase-3を光機能化し、その活性を光照射によって制御すること方法の確立を行った。Caspase-3はアポトーシスシグナル伝達の上流にあるプロテアーゼcaspase-8による特異的な切断(セリン176残基)により活性化されたため、この特異的な切断位置に光分解性の2-nitrophenylglycine(Npg)をペプチド主鎖に導入し光化学反応により活性の発現を試みた。ヒトcaspase-3のS176への位置特異的なNpg基の導入は、4塩基コドンと細胞外翻訳反応によって行った。Npgを導入したcaspase-3を用いて、光照射(366nm、0℃)を行い、基質であるDEVD(Asp-Glu-Val-Asp)の分解[(DEVD)2-rhodamine110で測定]を用いて活性を見た。光照射前(0min)では活性は見られないが、1分間の光照射で酵素活性の回復が見られた。caspase-3阻害剤(DEVD-CHO)の添加によってその活性が抑制されたことからこれらの活性がcaspase-3に由来することが確認された。次にcaspase-3の持つ自己切断と活性化の抑制について検討した。天然型では時間に依存して徐々に活性が増加するが、Npg-caspase-3では自己活性化は抑制され、光照射によって天然型と同様の自己活性化能を回復することが明らかとなった。このことから、Npgの位置選択的な導入によって、caspase-3の活性の制御が可能であることが明らかとなった。この結果、細胞内への光機能性caspase-3が導入と光照射によって、アポトーシスの誘導が可能性となると考えられる。これらの光機能化したcaspase-3を細胞に侵入可能にするため、HIV(ヒト免疫不全ウィルス)のTAT配列(YGRKKRRQRRR)をNまたはC末端に導入した光機能性caspase-3を上記と同じ方法で合成した。Npg導入によるcaspase-3活性の抑制及び光照射による活性化は、TAT配列を導入していないものと同様に制御できることが明らかとなった。これらの合成したTAT配列の導入されたNpg-caspase-3をヒトのT細胞(Jurkat T cell)内に効率よく取り込ませる実験と光照射によるアポトーシスの誘導を行うことができる環境が現在までの研究で整った。

To establish a method for photofunctionalization and photoinhibition of caspase-3 in the final stage of cancer cell removal by induction of caspase-3 (cell death). Caspase-3 is activated by a specific cleavage site (residue 176) in the upstream of the protein, and is introduced into the photochemical reaction site by a photolytic 2-nitrophenylglycine(Npg). The location-specific Npg gene of caspase-3 and S176 was introduced into the cell. Npg was introduced into caspase-3 and its activity was detected by light irradiation (366nm, 0℃) and matrix DEVD(Asp-Glu-Val-Asp) decomposition [(DEVD)2-rhodamine110]. Before light irradiation (0min), enzyme activity was restored. The addition of caspase-3 inhibitor (DEVD-CHO) inhibits the activity of caspase-3. Caspase-3 maintains its own shutdown and activation inhibition. The natural type increases its activity in a time-dependent manner, Npg-caspase-3 inhibits its activity, and light irradiates the natural type to restore its activity. The introduction and control of caspase-3 activity are possible. As a result, photofunctional caspase-3 in cells can be induced by light irradiation. The photofunctional caspase-3 was introduced into the N-terminal of TAT (YGRKRRQRRR) by the same method as described above. Npg introduction, inhibition of caspase-3 activity and light irradiation, activation, TAT alignment, introduction, and control The synthesis of TAT and the introduction of Npg-caspase-3 in Jurkat T cells were studied in detail.

项目成果

Photochemical regulation of the activity of an endonuclease BamHI using an azobenzene moiety incorporated site-selectively into the dimer interface

• DOI: 10.1039/b409844g
• 发表时间: 2004-01-01
• 期刊: CHEMICAL COMMUNICATIONS
• 影响因子: 4.9
• 作者: Nakayama, K;Endo, M;Majima, T
• 通讯作者: Majima, T

M.Endo, T.Majima: "Parallel, Double-Helix DNA Nanostructures Using Interstrand Cross-Linked Oligonucleotides with Bismaleimide Linkers"Angewante Chemie International Edition. 42. 5744-5747 (2003)

M.Endo、T.Majima：“使用带双马来酰亚胺接头的链间交联寡核苷酸的平行双螺旋 DNA 纳米结构”Angewante Chemie 国际版。

M.Endo, K.Nakayama, T.Majima: "Design and Synthesis of Photochemically Cont5rollable Restriction Endonuclease BamHI by Manipulating the Salt-Bridge Network in the Dimer Interface"Journal of Organic Chemistry. 69(in press). (2004)

M.Endo、K.Nakayama、T.Majima：“通过操纵二聚体界面中的盐桥网络设计和合成光化学可控限制性核酸内切酶 BamHI”有机化学杂志。

Unnatural base pairs mediate the site-specific incorporation of an unnatural hydrophobic component into RNA transcripts

• DOI: 10.1016/j.bmcl.2004.02.072
• 发表时间: 2004-05-17
• 期刊: BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS
• 影响因子: 2.7
• 作者: Endo, M;Mitsui, T;Yokoyama, S
• 通讯作者: Yokoyama, S

M.Endo, T.Majima: "Control of A Double Helix DNA Assembly by Use of Cross-Linked Oligonucleotides"Journal of The American Chemical Society. 125. 13654-13655 (2003)

M.Endo、T.Majima：“使用交联寡核苷酸控制双螺旋 DNA 组装”美国化学会杂志。