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等温遺伝子増幅法を応用したチェアーサイドでの歯周病細菌簡易検査法の確立

等温基因扩增法建立简易椅旁牙周病细菌检测方法

基本信息

批准号：
15791237
负责人：
前田博史
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

細菌検査は歯周病の病態を診断し,治療方針を決定する上で重要である。現在はPCR法を中心とした検査法が細菌検査の主流となっている。PCR法は従来の培養法にくらべ迅速性や感度にすぐれた方法である。しかし,歯科治療に臨床応用するには依然としてより迅速かつ簡便な細菌検査法の確立が望まれている。等温遺伝子増幅法(LAMP法)は等温で遺伝子増幅反応が継続するために遺伝子増幅効率が非常に高い。このため,LAMP法を応用することで迅速な細菌検査法を確立することが期待できる。本研究ではLAMP法を応用した歯周病細菌検査システムを開発するために以下の研究を行った。1.LAMP用プライマーの設計主要な歯周病細菌A.actionmycetemcomitans, P.gingivalis, T.denticola, F.nucleatum, P.intermediaそしてT.forsythiaの16SリボゾーマルRNA遺伝子の塩基配列からそれぞれの菌種に特異的な配列を選択してLAMP用プライマーを設計した。設計にはPrimer Explorer(Fujitsu)を使用した。2.LAMP反応条件の設定設計したプラィマーを用いてLAMP反応を行い,至適反応温度を調べた結果,64℃で反応させた場合に最も遺伝子の増幅効率が高かった。3.特異性・検出感度の検討各菌種に対するプライマーの特異性を調べた結果,すべてのプライマーは特異的に標的細菌の遺伝子のみを増幅させることが確認できた。またLAMP法による各細菌種の検出感度は10^2レベルであることが分かった。4.増幅遺伝子の検出方法の検討増幅遺伝子産物の検出方法として,電気泳動法,リアルタイムモニタリング法さらに目視判定法を検討した。結果,いずれの方法をもちいても増幅産物の検出が可能であることが分かった。以上の結果からLAMP法を応用した歯周病細菌検査の有用性が示された。

The diagnosis of bacterial diseases is important for treatment policy decisions. Now PCR is the main method of bacterial detection. PCR is a rapid and sensitive method. However, it is still desirable to establish a rapid and simple bacterial assay for clinical use in dental treatment. The isothermal amplification method (LAMP method) has a very high amplification rate compared to the isothermal amplification method. The LAMP method was used to establish rapid bacterial detection methods. The LAMP method was used to investigate the development of the following bacterial species. 1. LAMP primer design mainly includes A.actionmycetemcomitans, P. gingivalis, T.denticola, F.nucleatum, P. intermedia and T.forsythia's 16S ribosomal RNA gene. The primer sequence is specific to the species in which it is used. Designed by Primer Explorer(Fujitsu). 2. LAMP reaction conditions are designed to be used in the LAMP reaction, and the optimum reaction temperature is adjusted to 64 ℃. 3. Specificity and sensitivity were examined for each species. The results showed that the specificity of the target bacteria was increased. The sensitivity of each bacterial species detected by LAMP method was 10^2. 4. The detection method of amplitude-increasing gene and the detection method of amplitude-increasing gene products are discussed. As a result, the method of amplification is possible. The above results demonstrate the usefulness of LAMP in the detection of pathogenic bacteria.