STUDIES ON THE DYNAMICS OF PHOSPHOINOSITIDE PATHWAYS AND THE DEVELOPMENT OF FLUORESCENT BIOSENSORS

磷酸肌苷途径动力学研究及荧光生物传感器的开发

• 批准号: 16390532
• 负责人: TANIMURA Akihiko
• 金额: $ 9.07万
• 依托单位: Health Sciences University of Hokkaido
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16390532/
• 关键词: inositol 1,4,5-trisphosphate; fluorescent resonance energy transfer; fluorescent probe; fluorescent proteins; intracellular calcium ion; screening; imaging; inositol 1,4,5-trisphosphate receptor; イノシトール三リン酸; イノシトール三燐酸; カルシウム; FRET; IP_3受容体; c

LIBRA is a fluorescent biosensor for inositol 1,4,5-trisphosphate (IP_3), which is composed of the ligand-binding domain of the rat type III IP_3 receptor (IP_3R) and cyan and yellow fluorescent proteins. In the present study, we developed a series of IP_3 biosensors that exhibit strong pH stability and varying affinities for IP_3, as well as a method for the quantitative measurement of cytosolic concentrations of IP_3([IP_3]_i] in single living cells. Improved biosensors and the method for the quantitative measurement were used to elucidate IP_3dynamics during agonist-induced Ca2+ oscillations. Our result demonstrated cell type-dependent differences in IP_3dynamics; a non-fluctuating rise in [IP_3]_i and repetitive IP_3spikes during Ca^2+ oscillations in COS-7cells and HSY-EA1cells, respectively. The size of IP_3spikes in HSY-EA1cells varied from10to100nM, and the second and later spikes were initiated before the decline of [IP_3]_i to resting levels. While [IP_3]_i showed clear fluctuations at the beginning of Ca^2+ oscillations, repetitive spikes of [IP_3]_i gradually obscured during Ca^2+ oscillations. In addition, [IP_3]_i spike peaks were preceded by Ca^2+ spike peaks. These observations do not support the requirement of IP_3fluctuations in Ca^2+ oscillations.It is also found that LIBRA and its IP_3-insensitive variant should facilitate the detection of specific agonists and antagonists of the ligand-binding site of IP_3Rs. We applied this method for the screening of novel ligand for IP_3Rs. On the basis of computational docking of the ligands to the binding domain of the type I IP_3R, we synthesis of four novel metabolically stabilized analogues of IP_3. Of these analogues, two compounds were novel IP_3 ligands using LIBRA. We further examined the subtype specificity of adenophostin derivatives using series of LIBRA with ligand-binding domains of IP_3Rs from type I, II, or III.

LIBRA 是一种肌醇 1,4,5-三磷酸 (IP_3) 荧光生物传感器，由大鼠 III 型 IP_3 受体 (IP_3R) 的配体结合域以及青色和黄色荧光蛋白组成。在本研究中，我们开发了一系列具有强pH稳定性和对IP_3不同亲和力的IP_3生物传感器，以及定量测量单个活细胞中IP_3([IP_3]_i]胞质浓度的方法。改进的生物传感器和定量测量方法用于阐明激动剂诱导的Ca2+过程中IP_3的动力学。 振荡。我们的结果证明了 IP_3 动力学中细胞类型依赖性的差异； COS-7 细胞和 HSY-EA1 细胞中 Ca^2+ 振荡期间，[IP_3]_i 和重复 IP_3 尖峰分别出现非波动性上升。 HSY-EA1 细胞中 IP_3 尖峰的大小从 10 到 100nM 不等，第二个及以后的尖峰为 在 [IP_3]_i 下降至静止水平之前启动。虽然 [IP_3]_i 在 Ca^2+ 振荡开始时表现出明显的波动，但 [IP_3]_i 的重复尖峰在 Ca^2+ 振荡期间逐渐变得模糊。此外，[IP_3]_i 尖峰峰之前是 Ca^2+ 尖峰峰。这些观察结果不支持以下要求 Ca^2+振荡中的IP_3波动。还发现LIBRA及其IP_3不敏感变体应该有助于检测IP_3R配体结合位点的特异性激动剂和拮抗剂。我们应用这种方法来筛选IP_3Rs的新型配体。基于配体与 I 型 IP_3R 结合域的计算对接， 我们合成了四种新型代谢稳定的 IP_3 类似物。在这些类似物中，有两种化合物是使用 LIBRA 的新型 IP_3 配体。我们使用具有 I、II 或 III 型 IP_3R 配体结合域的 LIBRA 系列进一步检查了腺磷蛋白衍生物的亚型特异性。

项目成果

Improvement of FRET-based IP_3 biosensor and monitoring of IP_3 dynamics during Ca^<2+>oscillations in different cell types

基于FRET的IP_3生物传感器的改进和不同细胞类型Ca^2振荡期间IP_3动态的监测

• 发表时间: 2007
• 作者: 谷村 明彦;他4名;谷村明彦;Akihiko Tanimura;Akihiko Tanimura
• 通讯作者: Akihiko Tanimura

イノシトール三リン酸分子センサー“改良型LIBRA"のpH安定性と感受性の比較

肌醇三磷酸分子传感器“改良LIBRA”pH稳定性和灵敏度比较

• 发表时间: 2006
• 作者: 谷村 明彦;他4名;谷村明彦;Akihiko Tanimura;Akihiko Tanimura;Akihiko Tanimura;Akihiko Tanimura;谷村明彦
• 通讯作者: 谷村明彦

イノシトール三リン酸(IP_3)分子センサーのリンガーの最適化によるダイナミックレンジの改善

通过优化肌醇三磷酸 (IP_3) 分子传感器的 Ringer 来提高动态范围

• 发表时间: 2006
• 作者: 谷村 明彦;他4名;谷村明彦;Akihiko Tanimura;Akihiko Tanimura;Akihiko Tanimura;Akihiko Tanimura;谷村明彦;谷村明彦
• 通讯作者: 谷村明彦

FRETバイオセンサーを使ったIP_3ダイナミクスの解析と薬物スクリーニング

使用 FRET 生物传感器分析 IP_3 动力学和药物筛选

• 发表时间: 2007
• 作者: 谷村 明彦;他4名
• 通讯作者: 他4名

Synthesis and biological activity of metabolically stabilized cyclopentyl trisphosphate analogues of D-myo-Ins(1,4,5)P3.

D-myo-Ins(1,4,5)P3 代谢稳定的环戊基三磷酸类似物的合成和生物活性。

• DOI: 10.1002/cmdc.200700071
• 发表时间: 2007
• 期刊: ChemMedChem
• 影响因子: 3.4
• 作者: Zhang,Liuyin;Huang,Wei;Tanimura,Akihiko;Morita,Takao;Harihar,Sitaram;Dewald,DaryllB;Prestwich,GlennD
• 通讯作者: Prestwich,GlennD