生合成酵素の立体構造に基いた細胞内スフィンゴ脂質濃度の制御機構についての研究

基于生物合成酶三维结构的细胞内鞘脂浓度控制机制研究

• 批准号: 16770103
• 负责人: 生城 浩子
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: Osaka Medical College
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16770103/
• 关键词: スフィンゴ脂質; セリンパルミトイル転移酵素; PLP酵素

新規のセリンパルミトイル転移酵素(SPT)遺伝子4種類をクローニングし,全ての遺伝子〓いて大腸菌内大量発現系を構築した。それぞれの組み換え酵素の精製法を確立し,精製酵素標〓用いて一連の性状解析を行なった。以下に本研究で得られた結果をまとめる。(1)いずれの細菌由来のSPTもピリドキサール-5'-リン酸(PLP)を補酵素とし、420nm付近に〓クを持つ特徴的な吸収スペクトルを示した。(2)いずれのSPTもPLPと酵素のリシン残基との間で形成しているSchiff塩基の歪みに由来す〓偏光二色性スペクトルを示した。(3)アミノ酸基質であるL-セリンの結合によって、420nmの吸収ピークの増加が,円偏光二色性〓クトルにおいては、吸収ピークの符号の反転が観察された。これらのスペクトル変化の基質〓依存性より、L-セリンに対するSPTの解離定数を算出することができた。(4)定常常態下での酵素活性を測定し、Ordered Bi Bi機構に基づいた速度論的解析を行ない、〓のSPTについてKm,kcatなどの反応速度定数を求めた。(5)精製標品を抗原として、各SPTに対するポリクローナル抗体を作製した。金コロイドを利用〓免疫電子顕微鏡法により、SPTの菌体内部での局在を調べた。試験管内では水溶性酵素とし〓挙動を示すSPTであるが、電子顕微鏡観察の結果,細胞内膜近傍に偏在する像が得られたこ〓ら、菌体内部では表在性膜タンパク質として存在しているのではないかと考えられた。(6)Sphingobacterium由来SPTに関して、酵素タンパク質のアミノ酸基質複合体の結晶化とX線〓構造解析による立体構造決定に成功した。この構造に基づいて2つめの基質であるパルミト〓CoAが結合した後の反応中間体の構造モデルを作製した。

New rules の セ リ ン パ ル ミ ト イ ル planning shift enzyme (SPT) posthumous son 伝 4 kinds を ク ロ ー ニ ン グ し, full て の posthumous son 伝 〓 い て coliform extensive を 発 now department in constructing し た. The それぞれ group み is replaced with え enzyme and refined by を to establish を. The refined enzyme is labeled with それぞれ て in a row to analyze the properties of を lines なった. The following に the られた results obtained from で in this study をまとめる. (1) い ず れ の bacterial origin の SPT も ピ リ ド キ サ ー ル - 5 '- リ ン acid (PLP) を repair enzyme と し, pay nearly 420 nm に 〓 ク を hold つ な 収 absorption of 徴 ス ペ ク ト ル を shown し た. (2) い ず れ の SPT も PLP と enzyme の リ シ ン residues と の で formed between し て い る Schiff salt base の slanting み に origin す 〓 polarized light dichroism ス ペ ク ト ル を shown し た. (3) ア ミ ノ acid matrix で あ る L - セ リ ン の combining に よ っ て, 420 nm の suction 収 ピ ー ク の raised が, has drifted back towards &yen; polarized light dichroism 〓 ク ト ル に お い て は, suck 収 ピ ー ク の symbol の inverse planning が 観 examine さ れ た. こ れ ら の ス ペ ク ト ル variations change の matrix 〓 dependency よ り, L - セ リ ン に す seaborne る SPT の dissociation constant を calculate す る こ と が で き た. (4) under the state often で の determination of enzyme activity を し, Ordered Bi Bi institutions に づ い た speed theory of analytic line を な い, 〓 の SPT に つ い て Km, kcat な ど の anti 応 speed limit を め た. (5) refining the product を antigen と し て, SPT に す seaborne る ポ リ ク ロ ー ナ ル antibody を cropping し た. Jin コロ ドを ドを utilized the 〓 immune electron 顕 microscoping method によ and SPT <s:1> to locally regulate を and べた within the bacteria. Test tube で は water-soluble enzyme と し 〓 挙 dynamic を す in SPT で あ る が, electronic 顕 micromirror 観 examine の as a result, cells lining nearly alongside に partial in す る as が ら れ た こ 〓 ら, bacteria inside で は table in the sexual membrane タ ン パ ク qualitative と し て exist し て い る の で は な い か と exam え ら れ た. (6) Sphingobacterium origin SPT に masato し て, enzyme タ ン パ ク qualitative の ア ミ ノ acid matrix composite の crystallization と X-ray 〓 structure に よ る three-dimensional structure decision に successful し た. こ の に basis づ い て 2 つ め の matrix で あ る パ ル ミ ト 〓 CoA が combining し た の anti 応 intermediates の structure after モ デ ル を cropping し た.

项目成果

Reactions of serine palmitoyltransferase with serine and molecular mechanisms of the actions of serine derivatives as inhibitors

• DOI: 10.1021/bi035706v
• 发表时间: 2004-02-03
• 期刊: BIOCHEMISTRY
• 影响因子: 2.9
• 作者: Ikushiro, H;Hayashi, H;Kagamiyama, H
• 通讯作者: Kagamiyama, H

Binding of C5-dicarboxylic substrate to aspartate aminotransferase: Implications for the conformational change at the transaldimination step

• DOI: 10.1021/bi050071g
• 发表时间: 2005-06-14
• 期刊: BIOCHEMISTRY
• 影响因子: 2.9
• 作者: Islam, MM;Goto, M;Hayashi, H
• 通讯作者: Hayashi, H

Sphingolipid Biology (Structural Biology of Sphingolipid synthesis)

鞘脂生物学（鞘脂合成的结构生物学）

• 发表时间: 2006
• 作者: Ikushiro H;Okamoto A;Hayashi H
• 通讯作者: Hayashi H