Gel-phaseNMR法の開発と膜蛋白質への応用

凝胶相核磁共振方法的发展及其在膜蛋白中的应用

• 批准号: 16770116
• 负责人: 児嶋 長次郎
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16770116/
• 关键词: NMR; 樹脂固定化; 相互作用; 立体構造; 膜タンパク質

本研究では溶液NMRを用いたGel-phaseにおける蛋白質の立体構造解析法を確立し、膜蛋白質へ応用することを目指している。具体的には、溶液NMRによるGel-phase蛋白質の構造解析法の開発、可溶性向上を目指した融合蛋白質(可溶化タグ)の選択と溶液条件下における構造解析可能性の検討、無細胞蛋白質合成系を用いた可溶化タグ付加膜蛋白質の大量調製法の検討、界面活性剤共存下でのGel-phase NMRの膜蛋白質への応用を行う。本年度の実施実績は以下の通りである。昨年度に引き続き可溶性向上を目指した融合蛋白質(可溶化タグ)の選択と溶液条件下における構造解析可能性の検討、および、無細胞蛋白質合成系を用いた可溶化タグ付加膜蛋白質の大量調製法の検討を行った。光回避シグナルを伝える古細菌由来2回膜貫通型蛋白質pHtrIIについて加茂直樹教授(北大薬)の協力を得て大腸菌を用いた大量発現系によるNMR試料の調製を、また河野俊之チームリーダー(三菱化学生命研)の協力を得て4種(TRX、GST、GFP、MBP)の可溶化タグ融合蛋白質として小麦胚芽無細胞蛋白質合成系によるpHtrIIの大量調製を行い、溶液中やGel-phaseでの解析に最適なサンプル調製法を検討した。GSTタグは界面活性剤に対して不安定であり、膜蛋白質の構造解析には適していなかった。GFPタグやMBPタグは界面活性剤存在下においても安定であり、溶液中で比較的良好なスペクトルが得られることが分かった。今後はGFPタグやMBPタグを付加した蛋白質を樹脂担体へ安定に固定化する手法の開発を進める。

In this study, we established a method for the analysis of protein stereostructure by Gel-phase NMR and pointed out the application of membrane protein stereostructure. Specifically, the development of Gel-phase protein structure analysis method in solution NMR, the selection of fusion protein (solubilization) and the possibility of structure analysis in solution, the application of cell-free protein synthesis system, the study of solubilization and membrane protein mass modulation method, the application of Gel-phase NMR membrane protein under interface activity blue shift. The Group's performance for the year is as follows: A Study on the Selection of Soluble Fusion Proteins (Soluble Proteins) and the Possibility of Structural Analysis under Solution Conditions, and a Study on the Mass Preparation of Soluble Membrane Proteins for Cell-Free Protein Synthesis Systems. The light avoidance method was used to detect pHtrII protein in two layers of archaea. The cooperation of Professor Naoki Kamigo (Peking University) and Professor Shigeki Kono (Mitsubishi Chemical Life Research Institute) was used to obtain a large number of detection systems for Escherichia coli. The modulation of NMR samples was used to detect pHtrII protein in two layers.(TRX, GST, GFP, MBP) solubilization fusion protein and wheat germ cell-free protein synthesis system, pHtrII bulk modulation, solution and Gel-phase analysis, the most suitable modulation method was discussed. GSTs are not stable at the interface, but are suitable for structural analysis of membrane proteins. GFP can be used in the presence of surfactant to stabilize and improve the stability in solution. In the future, GFP will be added to the resin support to stabilize and immobilize the method.

项目成果

Amino acid residues involved in substrate recognition of the Escherichia coli ORF135 protein

参与大肠杆菌 ORF135 蛋白底物识别的氨基酸残基

• 发表时间: 2005
• 期刊: Biochemistry 44・15
• 作者: Numata;T.;Fukai;S.;Ikeuchi;Y;Suzuki;T.;Nureki;O.;Y.Tanaka;M.Mishima;Y.Tanaka;K.Furuita;Toshitatsu Kobayashi;Emiko Iida
• 通讯作者: Emiko Iida

Linker region of a Halobacterial transducer protein interacts directly with its sensor retinal protein

盐细菌转导蛋白的连接区与其传感器视网膜蛋白直接相互作用

• 发表时间: 2005
• 期刊: Biochemistry 44・16
• 作者: Numata;T.;Fukai;S.;Ikeuchi;Y;Suzuki;T.;Nureki;O.;Y.Tanaka;M.Mishima;Y.Tanaka;K.Furuita;Toshitatsu Kobayashi;Emiko Iida;Yuki Sudo
• 通讯作者: Yuki Sudo

Functional roles of the metal ion at the A9/G10.1 site in hammerhead ribozymes

锤头核酶 A9/G10.1 位点金属离子的功能作用

• 发表时间: 2004
• 期刊: J.Am.Chem.Soc. 126
• 作者: M.Hoshino;Y.O.Kamatari;S.Ohnishi;et al.(T.R.Obalinsky ed.);鎌足雄司他(桑田一夫編);Toshitatsu Kobayashi;Emiko Iida;Yuki Sudo;Kazuhiko Nakatani;Masaki Mishima;Emiko Kudo;Y.Tanaka
• 通讯作者: Y.Tanaka

Paramagnetic NMR study of Cu(2+)-IDA complex localization on a protein surface and its application to elucidate long distance information.

Cu(2 )-IDA 复合物在蛋白质表面定位的顺磁 NMR 研究及其在阐明长距离信息中的应用。

• 发表时间: 2004
• 期刊: FEBS Lett.2004 566:157-61.. 第566巻
• 作者: Horinouchi I.;Nakazato H.;Kawano T.;Iyama K.;Furuse A.;Arizono K.;Machida J.;Sakamoto T.;Endo F.;Hattori S.;Nomura M
• 通讯作者: Nomura M

Disassembling and bleaching of chroride-free pharaonis halorhodopsin by octyl-beta-glucoside

辛基-β-葡萄糖苷对无氯法老尼盐视紫红质的降解和漂白

• 发表时间: 2005
• 期刊: Biochemistry 44・39
• 作者: M.Hoshino;Y.O.Kamatari;S.Ohnishi;et al.(T.R.Obalinsky ed.);鎌足雄司他(桑田一夫編);Toshitatsu Kobayashi;Emiko Iida;Yuki Sudo;Kazuhiko Nakatani;Masaki Mishima;Emiko Kudo
• 通讯作者: Emiko Kudo