抗原ペプチドプロセシングにおける小胞体アミノペプチダーゼの作用メカニズムの解明

阐明内质网氨肽酶在抗原肽加工中的作用机制

• 批准号: 16790072
• 负责人: 服部 明
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16790072/
• 关键词: 小胞体アミノペプチダーゼ; 脂肪細胞由来ロイシンアミノペプチダーゼ; 白血球由来アルギニンアミノペプチダーゼ; 小胞体貯留機構; MHCクラスI抗原ペプチド; X線結晶構造解析; アミノペプチダーゼ; 胎盤性ロイシンアミノペプチダーゼ; オキシトシナーゼサブファミリー; 遺伝子発現調節機構

脂肪細胞由来ロイシンアミノペプチダーゼ(A-LAP)の小胞体内腔における貯留メカニズムを明らかにするために、それを制御しうる結合タンパク質の探索を行なった。本目的のため、A-LAPのC末端にFLAGタグを付加したA-LAP-FLAGタンパク質を恒常的に発現するHeLaS3細胞を作製した。作製した細胞の抽出液から、抗FLAG抗体を用いてA-LAP-FLAGを免疫沈降し、銀染色によって溶出画分に存在するタンパク質を可視化した。その結果、A-LAP-FLAG以外にも7種の分子が共沈していることがわかった。これら共沈分子の具体的な同定およびそのA-LAPの小胞体貯留への関与の検討は今後の課題として残った。前年度に引き続き、A-LAPの立体構造解明に向けたX線結晶構造解析に取り組んだ。これまでに解析可能な本酵素の結晶は得られていない。そこで、本酵素発現後の精製法および結晶化条件の再検討を行なった。その結果、バキュロウイルスを感染させたSf9細胞の培養液(3L)から、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー、キレートアフィニティーカラムクロマトグラフィー、疎水性カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーの順で精製を行なうことで、非常に高純度のA-LAPが十分量(〜10mg)得られることを見出した。現在、この高純度酵素標品を用い、結晶化条件の検討を進めている。また、結合糖を低下させたA-LAPや小胞体アミノペプチダーゼに特異な領域を欠失させたもの、前年度までの解析にて同定した結合タンパク質であるSDF2L1とA-LAPの複合体を用いて、結晶化を試みている。

Adipose cell origin and development (A-LAP) of small cell lumen storage and control of the development and control of the disease in combination with the quality of exploration. For this purpose, A-LAP and C-terminal FLAG are constantly produced in HeLaS3 cells. From the preparation of cell aspirates, A-LAP-FLAG was immunoprecipitated using anti-FLAG antibodies, and the presence of protein in dissolution samples was visualized using silver staining. 7 kinds of molecules except A-LAP-FLAG are co-precipitated. The relationship between the specific identity of these molecules and the microcellular storage of A-LAP is discussed. In the previous year, the three-dimensional structure analysis of A-LAP and the X-ray crystal structure analysis were selected. The enzyme may be analyzed and crystallized. The purification method and the re-evaluation of crystallization conditions after the enzyme was produced were carried out. Sf9 Cell Culture Solution (3L) for the detection of Sf9 cells was obtained with high purity A-LAP (~ 10mg). Now, the use of high purity enzyme standard, crystallization conditions for the discussion of progress. A-LAP is a complex formed by binding sugar to a specific domain, and the previous year's analysis is carried out in the presence of SDF.

项目成果

小胞体アミノペプチダーゼの発見とそのMHCクラスI抗原ペプチドプロセシングにおける役割

内质网氨肽酶的发现及其在 MHC I 类抗原肽加工中的作用

• 发表时间: 2005
• 期刊: 化学と生物 43巻11号
• 作者: 服部 明;辻本雅文
• 通讯作者: 辻本雅文

Endoplasmic reticulum aminopeptidase 1 mediates leukemia inhibitory factor-induced cell surface HLA-G expression in JEG-3 choriocarcinoma cells

内质网氨肽酶1介导白血病抑制因子诱导的JEG-3绒毛膜癌细胞表面HLA-G表达

• 发表时间: 2006
• 期刊: Endocrinology 147
• 作者: Katsumoto T.;Aikawa Y.;Atsushi Iwama A.;Ueda S.;Ichikawa H.;Ochiya T.;Kitabayashi I.;Y.Ohta;Shido F. et al.
• 通讯作者: Shido F. et al.

Distribution of Adipocyte-derived leucine aminopeptidase (A-LAP)/ER-aminopeptidase(ERAP)-1 in human uterine endometrium

脂肪细胞来源的亮氨酸氨肽酶(A-LAP)/ER-氨肽酶(ERAP)-1在人子宫内膜中的分布

• 发表时间: 2004
• 期刊: Journal of Histochemistry and Cytochemistry 52
• 作者: Okamoto;K;Kashima;K;Pereg;Y;Ishida;M;Yamazaki;S.Nota;A;Teunisse;A;Migliorini;D;Kitabayashi;I;Marine;JC;Prives;C;Shiloh;Y;Jochemsen;AG;Taya;Y.;H.Tamamura;Shibata D. et al.
• 通讯作者: Shibata D. et al.

The oxytocinase subfamily of M1 aminopeptidases

• DOI: 10.1016/j.bbapap.2004.09.011
• 发表时间: 2005-08-01
• 期刊: BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-PROTEINS AND PROTEOMICS
• 影响因子: 3.2
• 作者: Tsujimoto, M;Hattori, A
• 通讯作者: Hattori, A

Expression of endoplasmic reticulum aminopeptidases in EBV-B cell lines from healthy donors and in leukaemia/lymphoma, carcinoma and melanoma cell lines

健康供体 EBV-B 细胞系以及白血病/淋巴瘤、癌和黑色素瘤细胞系中内质网氨肽酶的表达

• 发表时间: 2006
• 期刊: J.Immunol. (in press)
• 作者: Fruci D.;et al.
• 通讯作者: et al.