アクチン細胞骨格の新しい制御蛋白質Nadrinの血小板産生過程における役割の解析

肌动蛋白细胞骨架的新型调节蛋白Nadrin在血小板生成过程中的作用分析

基本信息

批准号：
16790063
负责人：
原田史子
金额：
$ 1.66万
依托单位：
Teikyo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16790063/
关键词：
アクチン細胞骨格血小板巨核球 RhoGAP

项目摘要

巨核球系細胞株MEG-01をトロンボポエチン(TPO)またはホルボールミリステートアセテート(PMA)で刺激して分化を誘導し、Nadrin各スプライスバリアントの発現量をイムノブロットで調べた。このときGPIIIa特異的抗体を用いたイムノブロットでGPIIIaの発現量を調べ、MEG-01の成熟巨核球様細胞への分化誘導を確認した。TPO、PMAいずれで処理した場合にも4つのNadrinバリアントのうちNadrin104のみ発現が変化せず、Nadrin126、Nadrin116、Nadrin102は刺激開始後24時間から72時間の間に顕著に減少した。オルタナティブスプライシングの違いが検出可能なPCRプライマーを設計し、RT-PCRによる検討を行なったところ、分化刺激に伴いスプライシングのパターンに変化がみられた。この変化はイムノブロットでみられた発現量の変化と矛盾しない。従ってNadrinバリアントの発現量の変化はスプライシングパターンの変化により引き起こされたと考えられる。次にバリアント特異的抗体を用いた細胞染色によりNadrinバリアントの細胞内局在を調べた。分化誘導前のMEG-01ではNadrin104およびNadrin126は細胞質に存在が見られ、Nadrin102とNadrin116は細胞質だけでなく核にも存在することがわかった。これは核画分を調製して行なったイムノブロットによっても確認できた。現在Nadrinの分布が分化誘導に伴って変化するかを、細胞の形態の変化およびGPIIb/IIIaやP-セレクチンなどの分化マーカーの変化とあわせて検討している。

用血栓蛋白（TPO）或佛罗其肉豆蔻酸酯乙酸盐（PMA）刺激巨核细胞细胞系MEG-01诱导分化，并通过免疫印迹检查每个NADRIN剪接变体的表达水平。目前，通过使用GPIIIA特异性抗体进行免疫印迹检查了GPIIIA的表达水平，并确认将MEG-01诱导到成熟的巨核细胞细胞中。在四个纳德林变体中，只有nadrin104的四个纳德林变体中，表达没有变化，而nadrin126，nadrin116和nadrin102在刺激发作后的24至72小时之间显着降低。通过RT-PCR设计和检查了可以检测替代剪接差异的PCR引物，并通过分化刺激改变了剪接模式。这种变化与免疫印迹中看到的表达水平的变化一致。因此，认为纳德林变体的表达水平的变化是由剪接模式变化引起的。然后，使用变体特异性抗体通过细胞染色检查了纳德林变体的亚细胞定位。在分化诱导之前的MEG-01中，发现NADRIN104和NADRIN126存在于细胞质中，而Nadrin102和Nadrin116则存在于细胞核以及细胞质中。通过准备核分裂进行的免疫印迹也证实了这一点。当前，我们正在研究纳德林的分布是否随分化诱导的变化，以及细胞形态的变化以及分化标记的变化，例如GPIIB/IIIA和P-选择素。