アフリカトリパノソーマミトコンドリア末端酸化酵素キノール酸化反応の分子機構

非洲锥虫线粒体末端氧化酶对苯二酚氧化反应的分子机制

• 批准号: 16790244
• 负责人: 坂元 君年
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16790244/
• 关键词: トリパノソーマ; シアン耐性末端酸化酵素; アスコフラノン; キノール酸化酵素

研究計画は以下の3点に焦点を絞り研究を進めた。1)生化学的解析に適した、より高品質な含TAO大腸菌細胞膜の調製を目指した発現系の改良。2)大腸菌で発現させた組み換えTAOの物理化学的解析に適したタンパク精製法の開発。3)特異的阻害剤アスコフラノンおよび誘導体による構造活性相関からその阻害機構を明らかにする。1)ヘム欠損大腸菌の培養が僅かな条件の違いで増殖に大きな変化が見られることが原因で再現性良く組み換えTAOを発現させることが困難であった。そこで平面培地から本培養および発現誘導までのすべての段階の最適化を行い、安定して増殖速度、比活性共に今後の精製に十分であるものを得られるようになった。また、大腸菌の内膜のみを単離する事によって分光学的に扱いやすい膜画分を得ると共に、酵素の安定性も向上した。これは酵素活性の解析に適した膜サンプルである。2)膜タンパクの精製における最初の難関は可溶化である。種々の界面活性剤を検討した結果、界面活性剤単独での安定な可溶化は不可能であったが、マグネシウムイオン共存下でこれが達成できた。AOXにおいてマグネシウムの関与は全く予見されておらず、そのような報告もこれまでにはない。現在、精製の条件検討を行っている。3)アスコフラノンの誘導体を用いた構造活性相関研究により、阻害活性に必須なのはアスコフラノンの芳香環部分と炭素数7から15程度の疎水性側鎖であることが判明した。不斉炭素のあるフラノン環が必須でないことが判明したことから、合成誘導体による抗トリパノソーマ薬開発の可能性が大きく進展した。

研究计划的重点是以下三个点：1）改进旨在准备含有TAO的大肠杆菌细胞膜的表达系统的改进，适合生化分析。 2）开发适用于在大肠杆菌中表达的重组TAO的物理化学分析的蛋白质纯化方法。 3）从特定抑制剂的腹呋喃酮和衍生物中阐明了抑制的机制。 1）由于培养血红素缺乏的大肠杆菌条件的微小差异，很难用可重现的重组TAO表达重组TAO。因此，优化了从平面培养基到主要培养物和表达诱导的所有阶段，并且有可能获得稳定的生长速率和特定活性，足以足以进行将来的纯化。此外，通过仅分离大肠杆菌的内膜，可以获得易于在光谱上处理的膜馏分，并提高酶的稳定性。这是一个适合分析酶活性的膜样品。 2）纯化膜蛋白的第一个挑战是溶解化。由于检查了各种表面活性剂，因此不可能与表面活性剂稳定溶解化，但这是在存在镁离子存在下实现的。根本没有预见到镁在AOX中的参与，也没有提出这样的报告。目前，正在研究净化条件。 3）使用阿昔朗酮的衍生物的结构活性关系研究表明，紫蛋白酮的芳族环部分和疏水侧链具有约7至15个碳原子，对于抑制活性至关重要。已经发现，具有不对称碳的呋喃酮环并非必不可少，并且使用合成衍生物开发抗肌瘤药物的可能性得到了极大的改善。

项目成果

Mass spectrometric analysis of the ubiquinol-binding site in cytochrome bd from Escherichia coli

• DOI: 10.1074/jbc.m508206200
• 发表时间: 2006-01-27
• 期刊: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
• 影响因子: 4.8
• 作者: Matsumoto, Y;Murai, M;Mogi, T
• 通讯作者: Mogi, T

Alternative Oxidase (AOX) Genes of African Trypanosomes : Phylogeny and Evolution of AOX and Plastid Terminal Oxidase Families

非洲锥虫的替代氧化酶 (AOX) 基因：AOX 和质体末端氧化酶家族的系统发育和进化

• 发表时间: 2005
• 期刊: The Journal of Eukaryotic Microbiology 52
• 作者: Suzuki T;Hashimoto T;Yabu Y;Majiwa PA;Ohshima S;Suzuki M;Lu S;Hato M;Kido Y;Sakamoto K;Nakamura K;Kita K;Ohta N
• 通讯作者: Ohta N

Identification and characterization of amino acid residues essential for the active site of UDP-N-acetylenolpyruvylglucosamine reductase (MurB) from Staphylococcus aureus

金黄色葡萄球菌 UDP-N-乙酰烯醇丙酮酰葡萄糖胺还原酶 (MurB) 活性位点必需的氨基酸残基的鉴定和表征

• 发表时间: 2006
• 期刊: The Journal of Biological Chemistry 281
• 作者: Nishida S;Kurokawa K;Matsuo M;Sakamoto K;Ueno K;Kita K;Sekimizu K
• 通讯作者: Sekimizu K