アフリカトリパノソーマシアン耐性キノール酸化酵素の分子機構

非洲锥虫抗喹啉氧化酶的分子机制

• 批准号: 19790304
• 负责人: 坂元 君年
• 金额: $ 2.25万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-19790304/
• 关键词: トリパノソーマ; シアン耐性末端酸化酵素; アスコフラノン; キノール酸化酵素

本研究はアフリカトリパノソーマの寄生生活下でのエネルギー収支を調節しているシアン耐性末端酸化酵素(TAO)のキノール酸化反応の分子機構を解明することを目指し、大腸菌で発現させた組み換えTAOを用いて詳細な機能解析を行うものである。膜酵素であるTAOの可溶化後の安定化条件をもとにHis-Tagによるアフィニティ精製を行い、単一バンドのみが確認されるような精製TAOを安定に得ることが出来た。一段階の精製で十分な純度が得られたことから、数十mgスケールでの精製が比較的容易に出来るようになった。この精製TAOは酵素活性、阻害剤の感受性などにおいて可溶化前の膜から期待される性質を保持していた。さらに、この試料を用いICP-MSによる含有鉄定量を行った結果、酵素一分子に対して鉄が2原子含まれていることを初めて実験的に示すことになった。多くの金属含有酵素は可視光領域に吸収を持ち、すなわち色を持つが、これまで報告されている鉄二核錯体と同様に精製TAOは特に可視光領域の吸収を持たないことが確かめられた。次に精製TAOを用いた結晶化について検討した結果、まだ分解能は6A程度と低いものの、回折の得られる結晶化条件を見出した。これまでに結晶構造解析がなされている鉄二核錯体を持つタンパク質はすべて水溶性のタンパク質であり、膜タンパク質での結晶化の報告は未だ無い。この構造解析の結果はキノール酸化反応の機構を理解するのに有利であるだけでなく、膜結合性鉄二核錯体タンパク質の研究を牽引する研究になることが期待される。

这项研究旨在阐明抗氰抗性末端氧化酶（TAO）的奎因氧化反应的分子机制，该反应调节非洲锥虫锥虫寄生虫期间的能量平衡，并使用E. coli中表达的重组TAO进行详细的功能分析。基于膜酶道溶解后的稳定条件，使用HIS-TAG进行了稳定方法，即膜酶，并稳定地获得了纯化的Tao，其中仅确认了单个带。通过一个纯化步骤获得了足够的纯度，并且在几十毫克的规模上纯化变得相对容易。这种纯化的道可在酶活性和抑制剂敏感性方面溶解前从膜上预期的特性。此外，使用该样品使用ICP-MS对铁含量进行了定量，并且首次通过实验表明一种酶分子包含两个原子。尽管许多含金属的酶在可见光区域中都有吸收，也就是说，已经证实，像先前报道的二核络合物一样，纯化的陶氏在可见光的光区中没有吸收。接下来，我们使用纯化的TAO研究了结晶，尽管分辨率在约6A时仍然很低，但我们发现结晶条件允许衍射。到目前为止，所有具有经过晶体结构分析的蛋白质的蛋白质都是水溶性蛋白，尚无报告是膜蛋白质中结晶的。这种结构分析的结果不仅有助于理解喹诺尔氧化的机制，而且还有望导致对结合膜结合的铁核复合物蛋白进行研究。

项目成果

Change of subunit composition of mitochondrial complex II (succinate-ubiquinone reductase/quinol-fumarate reductase) in Ascaris suum during the migration in the experimental host

• DOI: 10.1016/j.parint.2007.08.002
• 发表时间: 2008-03-01
• 期刊: PARASITOLOGY INTERNATIONAL
• 影响因子: 1.9
• 作者: Iwata, Fumiko;Shinjyo, Noniko;Kita, Kiyoshi
• 通讯作者: Kita, Kiyoshi