ヒト破骨細胞形成系および骨吸収活性における関節リウマチ特異自己抗原の解析

ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を用いた破骨細胞形成系の確立およびRA自己抗原の発現1)Ficoll-Paqueを用いて健常人協力者よりPBMCを回収し、マグネットビーズと抗ヒトCD14モノクローナル抗体を用いてCD14(+)細胞を分離し、10%FBS・M-CSF(25ng/ml)入りαMEMにて培養を行い、Trypsin-EDTA処理後dish付着細胞を回収し、更に10%FBS・M-CSF(25ng/ml)・ODF(20ng/ml)入りのαMEMにて多核巨細胞を回収した。2)1)にて回収した多核巨細胞についてTRAP (Tartrate-resistant Acid Phosphatase)染色陽性であることを確認。また、成熟破骨細胞の機能を有するか否かを確認するため、dentin slice上でのPit formationを確認した。3)上記、ヒトPBMCからの成熟破骨細胞形成系において、RA自己抗原であるカルパイン・カルパスタチン,c-myc・FBPの発現をRT-PCRで確認した。ウサギ破骨細胞骨吸収におけるカルパイン阻害蛋白・抗ヒトカルパスタチン抗体の影響1)7日齢ウサギ長管骨をαMEM/5%FBSで細切した上清を、Unfractionated Bone Cells(UBC)とした。dentin slice上でUBCが骨吸収活性(pit formation)を有する系で、カルパイン阻害物質であるヒトCPSドメインI・カルパインインヒビターペプタイドが、骨吸収活性を抑制する可能性があることを確認した。2)ウサギUBCの系で、抗ヒトカルパスタチン抗体がコントロールIgGと比し、骨吸収活性を亢進する可能性があることを確認した。3)ウサギUBCの系で抗カルパスタチン抗体陽性RA患者血清は骨吸収活性に影響しないことを確認した。

ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を用いた破骨細胞形成系の確立およびRA自己抗原の発現1)Ficoll-Paqueを用いて健常人協力者よりPBMCを回収し、マグネットビーズと抗ヒトCD14モノクローナル抗体を用いてCD14(+)細胞を分離し、10%FBS・M-CSF(25ng/ml)入りαMEMにて培養を行い、Trypsin-EDTA処理後dish付着細胞を回収し、更に10%FBS・M-CSF(25ng/ml)・ODF(20ng/ml)入りのαMEMにて多核巨細胞を回収した。2)1)にて回収した多核巨細胞についてTRAP (Tartrate-resistant Acid Phosphatase)染色陽性であることを確認。また、成熟破骨細胞の機能を有するか否かを確認するため、dentin slice上でのPit formationを確認した。3)上記、ヒトPBMCからの成熟破骨細胞形成系において、RA自己抗原であるカルパイン・カルパスタチン,c-myc・FBPの発現をRT-PCRで確認した。ウサギ破骨細胞骨吸収におけるカルパイン阻害蛋白・抗ヒトカルパスタチン抗体の影響1)7日齢ウサギ長管骨をαMEM/5%FBSで細切した上清を、Unfractionated Bone Cells(UBC)とした。dentin slice上でUBCが骨吸収活性(pit formation)を有する系で、カルパイン阻害物質であるヒトCPSドメインI・カルパインインヒビターペプタイドが、骨吸収活性を抑制する可能性があることを確認した。2)ウサギUBCの系で、抗ヒトカルパスタチン抗体がコントロールIgGと比し、骨吸収活性を亢進する可能性があることを確認した。3)ウサギUBCの系で抗カルパスタチン抗体陽性RA患者血清は骨吸収活性に影響しないことを確認した。