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ヒト破骨細胞における関節リウマチ特異自己抗原の解析

人破骨细胞中类风湿性关节炎特异性自身抗原的分析

基本信息

批准号：
18790678
负责人：
野島崇樹
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18790678/
关键词：
関節リウマチ自己抗原破骨細胞

项目摘要

ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を用いた破骨細胞形成系の確立1) Ficoll-Paqueを用いて健常人協力者よりPBMCを回収し、マグネットビーズと抗ヒトCD14モノクローナル抗体を用いてCD14(+)細胞を分離し、10%FBS・M-CSF(25ng/ml)入りαMEMにて培養を行い、Trypsin-EDTA処理後dish付着細胞を回収し、更にFBS・M-CSF・ODF入りαMEMにて多核巨細胞を回収した。2) 1)にて回収した多核巨細胞についてTRAP (Tartrate-resistant Acid Phosphatase)染色陽性であることを確認。成熟破骨細胞は、5%FBSよりも10%FBS、ODF 20 40 100ng/mlのうち、100ng/mlにおいて、回収率がよいことが確認された。3) 成熟破骨細胞の機能を確認するため、carbonated calcium phosphate付着dish上でpit formationを確認した。成熟破骨細胞のpit formationについては、実験毎のばらつきが多く、一定した評価を確認することが難しかった。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を用いた破骨細胞形成系におけるRA自己抗原の発現1) 上記、ヒトPBMCからの成熟破骨細胞形成系において、カルパイン・カルパスタチン,c-myc・FBPの発現をRT-PCRで確認した。2) また、カルパイン・カルパスタチンについて、成熟破骨細胞における、蛋白発現をWestern blottingにて確認し、成熟に伴い、カルパイン・カルパスタチンの蛋白発現増加が確認された。

Establishment of osteoclast-forming lines in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) 1) Ficoll-Paque was used in healthy human collaborators to isolate PBMC from CD14 (+) cells, 10% FBS·M-CSF(25ng/ml) was used in αMEM culture, Trypsin-EDTA treated dish cells were recovered, FBS·M-CSF·ODF was used in αMEM culture. 2)1) Polynuclear giant cells were stained positive for TRAP (Tartrate-resistant Acid Phosphatase). Mature osteoclasts, 5% FBS, 10% FBS, ODF 20 40 100ng/ml, 100ng/ml, recovery rate 3)The function of mature osteoclasts is confirmed by the pit formation of carbonated calcium phosphate on the dish. The pit formation of mature osteoclasts is difficult to identify. 1) The expression of RA self-antigen in mature osteoclastogenic line from PBMC was confirmed by RT-PCR. 2)Western blotting for identification of mature osteoclasts, Western blotting for identification of mature osteoclasts, Western blotting for identification of mature osteoclasts, Western blotting for identification of protein expression of mature osteoclasts