ヒト破骨細胞における関節リウマチ特異自己抗原の解析

ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を用いた破骨細胞形成系の確立1) Ficoll-Paqueを用いて健常人協力者よりPBMCを回収し、マグネットビーズと抗ヒトCD14モノクローナル抗体を用いてCD14(+)細胞を分離し、10%FBS・M-CSF(25ng/ml)入りαMEMにて培養を行い、Trypsin-EDTA処理後dish付着細胞を回収し、更にFBS・M-CSF・ODF入りαMEMにて多核巨細胞を回収した。2) 1)にて回収した多核巨細胞についてTRAP (Tartrate-resistant Acid Phosphatase)染色陽性であることを確認。成熟破骨細胞は、5%FBSよりも10%FBS、ODF 20 40 100ng/mlのうち、100ng/mlにおいて、回収率がよいことが確認された。3) 成熟破骨細胞の機能を確認するため、carbonated calcium phosphate付着dish上でpit formationを確認した。成熟破骨細胞のpit formationについては、実験毎のばらつきが多く、一定した評価を確認することが難しかった。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を用いた破骨細胞形成系におけるRA自己抗原の発現1) 上記、ヒトPBMCからの成熟破骨細胞形成系において、カルパイン・カルパスタチン,c-myc・FBPの発現をRT-PCRで確認した。2) また、カルパイン・カルパスタチンについて、成熟破骨細胞における、蛋白発現をWestern blottingにて確認し、成熟に伴い、カルパイン・カルパスタチンの蛋白発現増加が確認された。

ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を用いた破骨細胞形成系の確立1) Ficoll-Paqueを用いて健常人協力者よりPBMCを回収し、マグネットビーズと抗ヒトCD14モノクローナル抗体を用いてCD14(+)細胞を分離し、10%FBS・M-CSF(25ng/ml)入りαMEMにて培養を行い、Trypsin-EDTA処理後dish付着細胞を回収し、更にFBS・M-CSF・ODF入りαMEMにて多核巨細胞を回収した。2) 1)にて回収した多核巨細胞についてTRAP (Tartrate-resistant Acid Phosphatase)染色陽性であることを確認。成熟破骨細胞は、5%FBSよりも10%FBS、ODF 20 40 100ng/mlのうち、100ng/mlにおいて、回収率がよいことが確認された。3) 成熟破骨細胞の機能を確認するため、carbonated calcium phosphate付着dish上でpit formationを確認した。成熟破骨細胞のpit formationについては、実験毎のばらつきが多く、一定した評価を確認することが難しかった。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を用いた破骨細胞形成系におけるRA自己抗原の発現1) 上記、ヒトPBMCからの成熟破骨細胞形成系において、カルパイン・カルパスタチン,c-myc・FBPの発現をRT-PCRで確認した。2) また、カルパイン・カルパスタチンについて、成熟破骨細胞における、蛋白発現をWestern blottingにて確認し、成熟に伴い、カルパイン・カルパスタチンの蛋白発現増加が確認された。