ヒトグラニュライシンのリコンビナント発現と機能解析

人颗粒溶素的重组表达及功能分析

• 批准号: 16790655
• 负责人: 宮田 聡子
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Kitasato University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16790655/
• 关键词: グラニュライシン; 抗菌蛋白; 抗腫瘍活性; 抗菌タンパク; 殺菌活性

グラニュライシンは、ヒトのキラーT細胞やナチュラルキラー(NK)細胞に存在する顆粒タンパクの1つであり、近年その抗腫瘍効果が明らかにされ、悪性腫瘍の治療の一端を担う可能性が示されている。また、グラニュライシンには、結核菌やブドウ球菌など微生物に対する殺菌作用があることも知られており、治療への応用が期待される。昨年は、ヒト末梢血単核球からLAK細胞を誘導し、cDNAを合成後、pET28aベクターのNde1サイトに増幅した238bpをクローニングし、E.Coli B株由来Rosetta(DE3)にヒスチジン融合蛋白として発現させる方法を試みたが、グラニュライシンの発現量は少なかった。本年度は、昨年度の結果を基に、まずグラニュライシン発現量を増加させることに主眼をおいて検討を行った。合成DNAを用い、コドンユーセージを大腸菌のコドンに最適化することで、大量発現が可能となった。封入体として得た蛋白を塩酸グアニジン溶液にて可溶化し、Ni-NTAカラムを用いて精製した。リーフォーデイング後、Salmonella typhimuriumに対する抗菌活性を指標に活性を検討したが、これには抗菌活性は認められなかった。そこで、次に可溶蛋白として発現させる為、GST(Glutathion S-transferase)との融合蛋白による発現を試み、可溶蛋白としての発現に成功した。現在、グルタチオンセファロースカラムにて精製し、抗菌活性を検討すると共に、S-S結合が構築できる新しい発現しシステムについても併せ検討している。

In recent years, the effect of anti-tumor therapy has become apparent, and one end of the possibility of treatment of malignant tumor has been shown. The role of tuberculosis in the prevention and treatment of tuberculosis In the past year, LAK cells were induced from peripheral blood mononuclear cells. After cDNA synthesis, pET28a protein was amplified to 238bp. E.Coli B strain was derived from Rosetta(DE3). This year, the results of the previous year were based on the increase in the number of reports. Synthetic DNA is optimized for use in E. coli and can be produced in large quantities. Encapsulated bodies are soluble in an acid solution and purified by Ni-NTA. The antibacterial activity of Salmonella typhimurium was determined by the activity index. The fusion protein of GST(Glutathion S-transferase) was successfully discovered. Now, in the process of purification, antibacterial activity, and S-S binding, a new method of discovery and evaluation has been developed.