ヒトグラニュライシンのリコンビナント発現と機能解析

人颗粒溶素的重组表达及功能分析

基本信息

批准号：
16790655
负责人：
宮田聡子
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16790655/
关键词：
グラニュライシン抗菌蛋白抗腫瘍活性抗菌タンパク殺菌活性

项目摘要

グラニュライシンは、ヒトのキラーT細胞やナチュラルキラー(NK)細胞に存在する顆粒タンパクの1つであり、近年その抗腫瘍効果が明らかにされ、悪性腫瘍の治療の一端を担う可能性が示されている。また、グラニュライシンには、結核菌やブドウ球菌など微生物に対する殺菌作用があることも知られており、治療への応用が期待される。昨年は、ヒト末梢血単核球からLAK細胞を誘導し、cDNAを合成後、pET28aベクターのNde1サイトに増幅した238bpをクローニングし、E.Coli B株由来Rosetta(DE3)にヒスチジン融合蛋白として発現させる方法を試みたが、グラニュライシンの発現量は少なかった。本年度は、昨年度の結果を基に、まずグラニュライシン発現量を増加させることに主眼をおいて検討を行った。合成DNAを用い、コドンユーセージを大腸菌のコドンに最適化することで、大量発現が可能となった。封入体として得た蛋白を塩酸グアニジン溶液にて可溶化し、Ni-NTAカラムを用いて精製した。リーフォーデイング後、Salmonella typhimuriumに対する抗菌活性を指標に活性を検討したが、これには抗菌活性は認められなかった。そこで、次に可溶蛋白として発現させる為、GST(Glutathion S-transferase)との融合蛋白による発現を試み、可溶蛋白としての発現に成功した。現在、グルタチオンセファロースカラムにて精製し、抗菌活性を検討すると共に、S-S結合が構築できる新しい発現しシステムについても併せ検討している。

颗粒素是在人类杀伤细胞和天然杀伤（NK）细胞中发现的颗粒蛋白之一，近年来已经揭示了其抗肿瘤作用，表明它可能在治疗恶性肿瘤的治疗中起作用。颗粒状素也已知对微生物（例如结核分枝杆菌和葡萄球菌）具有杀菌特性，并有望应用于治疗。去年，我们试图从人类外周血单核细胞中诱导LAK细胞，合成cDNA和克隆238bp，扩增到PET28A载体的NDE1位点，并将其表示为Rosetta（DE3）中的组氨酸融合蛋白（DE3），但来自E. coli B菌株的表达水平，但是Granulys nays sym symans Systrance Leass sym sym sym syble。今年，根据去年的结果，我们首先进行了一项研究，重点是提高颗粒素表达水平。通过使用合成DNA优化大肠杆菌中密码子的密码子Eusages，可以大量表达。将作为包含体获得的蛋白质溶解在盐酸盐酸盐溶液中，并使用Ni-NTA柱纯化。叶片后，使用针对伤寒沙门氏菌的抗菌活性作为指标检查活性，但未观察到抗菌活性。因此，为了将其表达为可溶性蛋白，使用具有GST的融合蛋白（谷胱甘肽S-转移酶）尝试了表达，并成功地作为可溶蛋白实现了表达。当前，该系统正在使用谷胱甘肽sepharose柱进行纯化，以研究其抗菌活性，并正在新的表达系统中进行研究，该系统允许构建S-S结合。