脊髄慢性圧迫モデルに対するb-FGF、NT-3発現ベクターの脊髄への直接導入

将b-FGF和NT-3表达载体直接导入脊髓用于慢性脊髓压迫模型

• 批准号: 16790829
• 负责人: 朝来野 佳三
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Dokkyo Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16790829/
• 关键词: chronic spinal cord compression; basic-FGF; neurotrophin-3; gene therapy; neuronal protection

平成17年度は、16年度に引き続き(1)b-FGF,NT-3遺伝子の細胞への導入、(2)ラット脊髄慢性圧迫モデル(sublaminal progressive compression model)の作成を行った。(1)b-FGF遺伝子のプラスミドよりそれぞれのcDNAを切り出し、コスミドを作製しこれらをアデノウィルスベクターを作成した。まず、NRK細胞(ラット正常腎臓由来)へ導入する。遺伝子導入操作を終えた細胞をG-418(neomycin analogue)存在下で培養し、生き残った細胞をクローニングし、現在、b-FGF,NT-3遺伝子が導入されていることを確認している。方法としてはSouthern blot法にてb-FGF,BDNF遺伝子が導入されているか確認している。さらに、これらの細胞株についてNorthern blot法を用いてmRNAが導入されているかを確認する。これにより、導入が確認できたクローンでBDNF mRNAの発現を確認する。これらで得られた細胞株に対してWestern blottingを行い、細胞内でBDNF蛋白が産生されているかの確認を行う。さらに、酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)を行い、細胞の蛋白産生を確認する。以上によりb-FGF産生細胞株を樹立する。(2)Wister ratを用い、全身麻酔下にて、第5、第6頚椎椎弓下にcompression materialを挿入し慢性圧迫モデルを作成した。術後、自発的運動量と、強制運動量を回転式運動量測定ケージおよびトレッドミル、傾斜姿勢維持測定板にてそれぞれ計測した。術後、24週になると運動機能の低下が見られ始める。この時期には、脊髄前角細胞も減少してくるのだが、ここで全身麻酔下にて、NT-3産生細胞とb-FGF産生細胞をそれぞれ1×10^6 cellsずつ脊髄圧迫部位に移植した。また、NT-3産生細胞およびb-FGF産生細胞の単独移植群も作製する。その後、細胞移植をしていないcontrol群とNT-3産生細胞+b-FGF産生細胞同時移植群、NT-3産生細胞群単独移植群、b-FGF産生細胞単独移植群それぞれについて、自発的運動量、強制運動量を測定する。以上のように、現在安定した細胞株樹立を目指している。また、脊髄慢性圧迫モデルについてコントロールとしてb-FGF,NT-3の発現を蛍光抗体法を用いて検討している。さらに、脊髄血流の変化に注目し、これを定量化することで改善度の評価に役立てることができると考え今後検討を加えることにしている。

In 2017 and 2016, we conducted research on (1) introduction of b-FGF,NT-3 gene into cells, and (2) creation of sublaminar progressive compression model. (1) The b-FGF gene was cloned into the cDNA library and the cDNA library was constructed. NRK cells (normal kidney origin) were introduced into the cells. The gene transfer operation was carried out in the presence of G-418(neomycin analog), and the cells were cultured, cultured, and cultured with b-FGF and NT-3 gene transfer. Methods: Southern blot method was used to confirm b-FGF and BDNF gene introduction. Northern blot analysis was used to confirm the presence of mRNA in these cells. The expression of BDNF mRNA was confirmed by PCR. The results of Western blotting and identification of BDNF protein production in cells were analyzed. In addition, enzyme binding assay (ELISA) was performed to confirm the protein production of cells. B-FGF producing cell lines were established. (2)Wister rat is used in the middle, general anesthesia, compression material under the fifth and sixth vertebral arches, and chronic compression is produced. Postoperatively, spontaneous exercise, stress exercise, backward-type exercise measurement, and tilt posture maintenance measurement were measured. After surgery, motor function decreased at 24 weeks. At this time, the number of cells in the anterior horn of the spinal cord decreased, and the number of NT-3-producing cells and b-FGF-producing cells decreased. 1×10^6 cells were transplanted into the spinal cord. Single transplantation of NT-3-producing cells and b-FGF-producing cells After that, the control group of cell transplantation, the simultaneous transplantation group of NT-3-producing cells +b-FGF-producing cells, the single transplantation group of NT-3-producing cells, and the single transplantation group of b-FGF-producing cells were prepared, and the amount of spontaneous exercise and the amount of forced exercise were measured. The above mentioned cell lines are stable now. The development of NT-3 was investigated by light antibody method. For example, if you want to improve the quality of blood flow, you should pay attention to it.