脊髄慢性圧迫モデルに対するb-FGF、NT-3発現ベクターの脊髄への直接導入

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平成17年度は、16年度に引き続き(1)b-FGF,NT-3遺伝子の細胞への導入、(2)ラット脊髄慢性圧迫モデル(sublaminal progressive compression model)の作成を行った。(1)b-FGF遺伝子のプラスミドよりそれぞれのcDNAを切り出し、コスミドを作製しこれらをアデノウィルスベクターを作成した。まず、NRK細胞(ラット正常腎臓由来)へ導入する。遺伝子導入操作を終えた細胞をG-418(neomycin analogue)存在下で培養し、生き残った細胞をクローニングし、現在、b-FGF,NT-3遺伝子が導入されていることを確認している。方法としてはSouthern blot法にてb-FGF,BDNF遺伝子が導入されているか確認している。さらに、これらの細胞株についてNorthern blot法を用いてmRNAが導入されているかを確認する。これにより、導入が確認できたクローンでBDNF mRNAの発現を確認する。これらで得られた細胞株に対してWestern blottingを行い、細胞内でBDNF蛋白が産生されているかの確認を行う。さらに、酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)を行い、細胞の蛋白産生を確認する。以上によりb-FGF産生細胞株を樹立する。(2)Wister ratを用い、全身麻酔下にて、第5、第6頚椎椎弓下にcompression materialを挿入し慢性圧迫モデルを作成した。術後、自発的運動量と、強制運動量を回転式運動量測定ケージおよびトレッドミル、傾斜姿勢維持測定板にてそれぞれ計測した。術後、24週になると運動機能の低下が見られ始める。この時期には、脊髄前角細胞も減少してくるのだが、ここで全身麻酔下にて、NT-3産生細胞とb-FGF産生細胞をそれぞれ1×10^6 cellsずつ脊髄圧迫部位に移植した。また、NT-3産生細胞およびb-FGF産生細胞の単独移植群も作製する。その後、細胞移植をしていないcontrol群とNT-3産生細胞+b-FGF産生細胞同時移植群、NT-3産生細胞群単独移植群、b-FGF産生細胞単独移植群それぞれについて、自発的運動量、強制運動量を測定する。以上のように、現在安定した細胞株樹立を目指している。また、脊髄慢性圧迫モデルについてコントロールとしてb-FGF,NT-3の発現を蛍光抗体法を用いて検討している。さらに、脊髄血流の変化に注目し、これを定量化することで改善度の評価に役立てることができると考え今後検討を加えることにしている。