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細胞型特異的転写活性定量法によるエストロジェン受容体の転写調節機能の解析

使用细胞类型特异性转录活性测定分析雌激素受体的转录调节功能

基本信息

批准号：
16790945
负责人：
石田真帆
金额：
$ 2.05万
依托单位：
University of Yamanashi
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

Adenovirus vectorによるCre/loxPシステムを用いて、プロラクチン(PRL)細胞特異的なestrogen receptor (ER)転写活性検出系を確立した。Adenovirus vectorは、PRL promoter調節下に核移行シグナルを連結したCreリコンビナーゼを発現させるAd-Prl/NCre、独自に作成した2×ERE配列にminimal thymidine kinase promoter、loxP配列で挟んだstuffer DNA、luciferase遺伝子を連結したAd-2ERE.loxP/Luc、対照用として、Ad-2ERE.loxP/Lucから2×ERE配列のみを除去したAd-TK.loxP/Lucを作成して用いた。1.まずadenovirus vectorを感染させた初代培養下垂体前葉細胞をメタノール固定し、免疫染色法によりCreリコンビナーゼ蛋白及びluciferase蛋白がPRL細胞特異的に発現し、Cre/loxPシステムが機能していることを確認した。2.エストロジェン刺激によるER転写活性誘導率は、無血清培養条件下では約1.5倍であったが、dextran-charcoalで処理した血清添加培養条件下では約9倍と、より明確な活性誘導が認められた。3.Luciferase遺伝子発現は、ICI182,780により抑制されたことから、この遺伝子発現がER特異的な細胞内システムにより誘導されることを確認した。本研究は、このER転写活性検出系を用いて、初代培養PRL細胞におけるリガンド非依存性のER活性化の検討を行うことを念頭に行ったものである。

Adenovirus vector estrogen receptor (ER) writing activity is confirmed by using the estrogen receptor (ER) writing activity of the special cell (PRL). Under Adenovirus vector, PRL promoter, nuclear transfer, link, Cre transfer, link, delete Ad-TK.loxP/Luc, remove Ad-TK.loxP/Luc, configure minimal thymidine kinase promoter, loxP, stuffer DNA, luciferase, ERE, remove Ad-TK.loxP/Luc to make use of. 1. The primary culture of adenovirus vector infection showed that the anterior pituitary cells were fixed, the immunostaining method was used to detect the expression of protein and luciferase protein PRL, and the Cre/ loxPacker was used to detect the specificity of the PRL protein. two。 The rate of ER writing activity was about 9 times higher than that under the condition of serum-free culture, that of serum-free culture was about 1.5-fold, that of serum-free culture was about 9-fold, and that of serum-free culture was 9 times higher than that of serum culture. The 3.Luciferase gene is detected, the ICI182780 gene is suppressed, and the ER-specific intracellular signal is detected. In this study, the activity of ER is derived from the primary culture of PRL cells, which is independent of the activity of ER.