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細胞型特異的転写活性定量法によるエストロジェン受容体の転写調節機能の解析

使用细胞类型特异性转录活性测定分析雌激素受体的转录调节功能

基本信息

批准号：
16790945
负责人：
石田真帆
金额：
$ 2.05万
依托单位：
University of Yamanashi
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

Adenovirus vectorによるCre/loxPシステムを用いて、プロラクチン(PRL)細胞特異的なestrogen receptor (ER)転写活性検出系を確立した。Adenovirus vectorは、PRL promoter調節下に核移行シグナルを連結したCreリコンビナーゼを発現させるAd-Prl/NCre、独自に作成した2×ERE配列にminimal thymidine kinase promoter、loxP配列で挟んだstuffer DNA、luciferase遺伝子を連結したAd-2ERE.loxP/Luc、対照用として、Ad-2ERE.loxP/Lucから2×ERE配列のみを除去したAd-TK.loxP/Lucを作成して用いた。1.まずadenovirus vectorを感染させた初代培養下垂体前葉細胞をメタノール固定し、免疫染色法によりCreリコンビナーゼ蛋白及びluciferase蛋白がPRL細胞特異的に発現し、Cre/loxPシステムが機能していることを確認した。2.エストロジェン刺激によるER転写活性誘導率は、無血清培養条件下では約1.5倍であったが、dextran-charcoalで処理した血清添加培養条件下では約9倍と、より明確な活性誘導が認められた。3.Luciferase遺伝子発現は、ICI182,780により抑制されたことから、この遺伝子発現がER特異的な細胞内システムにより誘導されることを確認した。本研究は、このER転写活性検出系を用いて、初代培養PRL細胞におけるリガンド非依存性のER活性化の検討を行うことを念頭に行ったものである。

Adenovirus vector によるCre/loxPシステムを was established using the いて, プロラクチン (PRL) cell-specific estrogen receptor (ER) inactivation system. Adenovirus vector, nuclear migration under the regulation of PRL promoter, linkage, crere, ligation, Ad-Prl/NCre, original creation, 2×ERE arrangement, minimal thymidine kinase promoter, loxP alignment and stuffer DNA, luciferase left 伝子をconnected したAd-2ERE.loxP/Luc, 対母として, Ad-2ERE.loxP/Lucから2×ERE arrangement のみをremoved したAd-TK.loxP/Lucをproduced して用いた. 1.まずadenovirus The vector infected the primary cultured anterior pituitary gland cells and fixed them, and the immunostaining method used Cre-rein protein and The specificity of PRL cell-specific luciferase protein has been demonstrated, and the function of Cre/loxP has been confirmed. 2. The induction rate of ESTOCK-stimulated ER activity is approximately 1.5 times under serum-free culture conditions, dex. The tran-charcoal treatment can be performed by adding serum to the culture conditions, which is about 9 times, and the activity induction can be clearly understood. 3.Luciferase is present and inhibited by ICI182,780から、この缝子発appears ER-specific intracellular システムにより induction されることをconfirmationした. In this study, the ER active writing system was used, and the primary cultured PRL cells were used.リガンド Non-dependent ER activation の検question を行うことをthought に行ったものである.