日本におけるQoI剤耐性うどんこ病菌の分子生物学的スクリーニング方法の開発

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環境負荷の少ない天然物をリード化合物とするQoI剤は、今日世界で最も重要かつ汎用される農業用殺菌剤の1つである。しかし、諸外国同様我が国でもいち早くQol剤耐性菌が出現し、農業環境とりわけ微生物相の撹乱と薬剤効果の低下が問題になっている。そこで本研究では、人工培養が出来ないために薬剤耐性の検定に困難を極めている重要病原菌、ウリ類うどんこ病菌とイチゴうどんこ病菌を対象に、QoI剤耐性の分子機構解明に基づいて耐性菌の迅速な遺伝子診断法を開発する。これにより耐性菌の早期診断法が農業現場に近い各地の試験場や病害虫防除所等に普及し、耐性菌のモニタリングによる被害の発生回避が期待できる。QoI剤耐性菌では、この薬剤が作用するタンパク質であるチトクロームbの薬剤結合部位に相当するコドン143に、アミノ酸置換を伴う耐性変異がみられることを既に明らかにした。しかし、チトクロームb遺伝子はコピー数が多く、QoI剤耐性変異遺伝子と野生型(薬剤感受性型)遺伝子が種々の割合で混在する、ヘテロプラスミーとよばれる現象がしばしばみられた。また、チトクロームb遺伝子中の変異遺伝子の割合によって、QoI剤の効果が異なることが示唆された。そこで、19年度はウリ類うどんこ病菌やイチゴうどんこ病菌、灰色かび病菌について、QoI剤耐性の原因となるチトクロームb遺伝子の各種定量法を検討した。その結果、蛍光標識プライマーを用いて増幅したチトクロームb遺伝子のPCR産物を、制限酵素Fnu4HI(=ItaI)で処理後キャピラリー電気泳動し、機器FMBI0によって蛍光強度を測定することで、QoI剤耐性変異遺伝子を存在比1%のレベルまで検出することを可能にした。